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1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安微　合肥　230031；2 江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇　南京　210028

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，在我國，其發(fā)病率與死亡率亦居各種惡性腫瘤的首位。其中非小細胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC)作為肺癌的主要類型之一，占肺癌患者的85%以上，并且多數(shù)患者確診時已處于晚期，喪失了手術(shù)治療的機會[1]，而引起非小細胞肺癌的主要原因是由于EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生長因子受體)突變，尤其是二次突變T790M[2]和c-Met的擴增[3]。非小細胞肺癌細胞H1975含有T790M和L858R雙突變，作為由T790M突變導(dǎo)致的EGFR-TKI獲得性耐藥研究模型得到廣泛應(yīng)用[4]，H1975細胞對吉非替尼的耐藥性為PC9細胞的100倍以上，其機制可能與調(diào)控T790M突變亞群細胞中的基因參與EGFR-TKI耐藥機制有關(guān)[5]。

隨著表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑( EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors，EGFR-TKIs)的出現(xiàn)，顯著延長了患者的生存期，改善了患者的生活質(zhì)量，從而改變了肺癌的標準治療模式[4]。第一代可逆性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼的產(chǎn)生對于EGFR突變的肺癌患者有顯著的臨床療效，并得到了廣泛的使用，其主要作用機制是競爭性結(jié)合EGFR胞內(nèi)域上的結(jié)合位點，阻止EGFR受體憐酸化，從而阻止EGFR產(chǎn)生的信號向下游傳遞，抑制其下游PI3K/AKT/mTOR通路激酶的活性，阻礙腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、血管生成且誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[6]。但隨著患者用藥時間的延長，產(chǎn)生了嚴重的耐藥反應(yīng)，抗腫瘤作用明顯下降，限制了吉非替尼在臨床上的應(yīng)用[7]。因此，研究如何防治吉非替尼耐藥成為治療非小細胞肺癌的關(guān)鍵。

近年來，中藥與吉非替尼聯(lián)用已經(jīng)成為治療肺癌的熱點。例如，大黃素聯(lián)合吉非替尼可明顯抑制HCC827·GR細胞株p-EGFR，p-ERK1·2，p-Met的表達[8]；姜黃素聯(lián)合吉非替尼用于PC-9·G2，其細胞存活率比單用吉非替尼組降低13%～22%[9]。金復(fù)康處方為全國中醫(yī)腫瘤治療中心的劉嘉湘教授經(jīng)30余年的臨床實踐歸納所得，金復(fù)康與化療藥并用，有助于提高化療效果，改善免疫功能，減輕化療引起的白細胞下降。金復(fù)康優(yōu)化方(ALG-X-012)是由江蘇省中醫(yī)藥研究院在對金復(fù)康二次開發(fā)的基礎(chǔ)上，針對金復(fù)康處方中組分結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化研究而成，使其處方更加簡單有效地發(fā)揮抗癌作用，本研究擬通過MTT比色法，細胞劃痕實驗，流式細胞術(shù)，蛋白質(zhì)印跡法考察了優(yōu)化方ALG-X-012聯(lián)用吉非替尼對非小細胞H1975的增殖影響并初步探討了其作用機制與EGFR-PI3k-AKT信號通路可能的關(guān)系。

1　儀器與材料

1.1材料ALG-X-012(黃芪飲片：批號20160513；麥冬飲片：批號20160718；淫羊藿飲片：批號20160601；黃精飲片：批號20160625，安徽井泉中藥飲片有限公司)。四甲基偶氮藍( MTT，美國Sigma公司)，DMSO(Amresco，美國)，吉非替尼 ( Gefitinib，CAS: 184475-35-2， 美國 Selleck 公司)。吉非替尼用DMSO配成10 mmol/L儲備液，-20 ℃保存。RPMI1640 培養(yǎng)液、0.25% Tripsin(南京凱基生物)，細胞培養(yǎng)皿(Corning，美國)，PBS(Hyclone，美國)，DMEM(Corning，美國)，F(xiàn)BS(ExCell，美國)，6 well cell culture plate(Corning，美國)，乙醇(國藥)，Annexin V-APC·7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物)，細胞周期檢測試劑盒、全蛋白抽提試劑盒、Braford蛋白含量檢測試劑盒、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、預(yù)染蛋白分子量、電轉(zhuǎn)移緩沖液、麗春紅染色液、ECL檢測試劑盒、顯影定影試劑等均購自碧云天公司，p-EGFR(博士德，Bm4115，稀釋比：1∶200)，p-mTOR(abcam，Ab137133，1∶1000)，P-AKT(Cell signaling，#4060，1∶1000)，β-actin(博士德，Bm0627，1∶500)。

1.2儀器CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，生物安全柜(Thermo，美國)，低速離心機(Thermo，美國)，微量移液器(Thermo，美國)，Milli-Q純水機(Millipore，美國)，全自動酶標儀(Thermo Electrom，美國)，倒置顯微鏡(Leica，德國)，流式細胞儀(Merck，德國)。

2　方法

2.1ALG-X-012的制備黃芪、黃精、麥冬以及淫羊藿按照87∶12∶77∶24的比例首次煎煮用10倍量的水，煎煮2 h后，再用8倍量的水煎煮，將兩次的煎煮液合并，旋蒸濃縮至50 mL，過膜備用。

2.2細胞培養(yǎng)人肺腺癌細胞株H1975購于復(fù)旦大學(xué)細胞庫，來源于美國物種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。用含10%胎牛血清及100U·mL青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，用0.25% 胰蛋白酶消化傳代。

2.3MTT法測定聯(lián)合用藥對細胞增殖的影響取指數(shù)生長期的H1975細胞，2000 r·min-1離心2 min，棄去上清液，用培養(yǎng)液打勻，制成細胞懸液。用血細胞計數(shù)板計數(shù)后，稀釋成濃度為4×104個細胞/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后分別給予空白對照組(RPMI1640無血清培養(yǎng))，ALG-X-012(0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/mL) 、吉非替尼( 0.1、1，2、3、5、10、20 μmol/L) 及ALG-X-012(1 mg/mL) 加吉非替尼( 1 μmol/L) 聯(lián)合干預(yù)，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。72 h后，每孔加入20 μL MTT( 5 mg/mL) ，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩后置酶標儀上于570 nm處測定每孔的吸光度( OD值)。

細胞存活率( %) = (給藥組OD均值- 空白組OD值) /(對照組OD均值-OD空白組值) ×100%。

2.4劃痕實驗檢測聯(lián)合用藥對細胞遷移的影響收集處于對數(shù)生長期細胞，按每孔1×105個細胞接種6孔板，培養(yǎng)24 h后棄上清液，實驗設(shè)正常細胞對照組和不同藥物實驗組，用10μl槍頭垂直劃出劃痕，實驗孔分別加入無血清的RPMI1640培養(yǎng)對照組，ALG-X-012(1 mg/mL)、吉非替尼(1 μmol/L)以及兩藥聯(lián)合(1 mg/mL ALG-X-012與1 μmol/L吉非替尼)培養(yǎng)基4 mL。于0 h、12 h、24 h在顯微鏡下拍照，得出劃痕寬度與面積。

劃痕面積=劃痕長度×劃痕寬度。

2.5流式細胞術(shù)檢測聯(lián)合用藥對細胞凋亡的影響取對數(shù)生長期的細胞，按照每孔1×105個接種于6孔板中，按照空白組、ALG-X-012(1 mg/mL)、吉非替尼(1 μmol/L)、聯(lián)合給藥組(1 mg/mL ALG-X-012與1 μmol/L吉非替尼)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，用胰酶消化細胞。用PBS清洗細胞兩次，離心收集細胞，不少于1×105個細胞。加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-APC混勻后，加入 5 μL 7-AAD染液混勻。室溫下避光保存5～15 min，于流式細胞儀中檢測。

2.6Western Bolt檢測細胞相關(guān)蛋白細胞接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按照空白對照組、ALG-X-012(1 mg/mL)、吉非替尼(1 μmol/L)、聯(lián)合給藥組(1 mg/mL ALG-X-012與1 μmol/L吉非替尼)，將細胞用胰酶消化后，各加入200 ul冰預(yù)冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30 min，充分裂解，于4 ℃，13000 r·min[-1]離心10 min。將上清分裝，存于-20 ℃?zhèn)溆?。?yīng)用BCA分析試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白在SDS-PAGE電泳分離， 轉(zhuǎn)膜至PVDF膜并作好標記，用TBST洗膜 10 min 3次。加入含5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃搖床振蕩孵育過夜，TBST洗10 min 3次。加入二抗室溫反應(yīng)2 h，用TBST洗膜5～10 min。將ECL化學(xué)發(fā)光液暗盒中曝光。使用Gel-Pro32軟件對結(jié)果進行灰度分析。

3　結(jié)果

3.1MTT法檢測聯(lián)合用藥對細胞增殖的影響ALG-X-012組、吉非替尼組以及兩者聯(lián)合用藥對H1975細胞增殖比較結(jié)果如圖1所示，低濃度(0.1～5 μmol·L)吉非替尼對H1975細胞的增殖沒有顯著的抑制作用，當(dāng)吉非替尼濃度超過5 μmol/L時，對H1975細胞增殖有抑制作用，IC50=9.542±1.20 μmol/L。單獨使用濃度范圍在0.0625～16 mg/mL的ALG-X-012作用于耐藥H1975細胞72 h，其對H1975細胞增殖沒有明顯抑制作用。ALG-X-012(1 mg/mL)與吉非替尼(1 μmol/L)聯(lián)合后，H1975細胞增殖被明顯抑制(細胞存活率為52%)，比吉非替尼相比，抑制細胞增殖率提高了37%，出現(xiàn)ALG-X-012逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的現(xiàn)象。

3.2劃痕實驗檢測聯(lián)合用藥對細胞遷移的影響各給藥組對H1975細胞遷移能力的影響結(jié)果如圖2所示，分別給藥0 h，12 h，24 h之后，空白對照組，ALG-X-012組及吉非替尼組對于H1975細胞都有不同程度的遷移，劃痕寬度以及面積明顯減少。聯(lián)合用藥組在12 h和24 h，劃痕寬度及面積與空白組比較有顯著變化，其劃痕寬度比空白組多22%～30%，面積多15%～28%，說明聯(lián)合用藥組能夠抑制細胞遷移。進一步說明ALG-X-012可以增強吉非替尼給藥對H1975細胞的抑制作用。

3.3流式細胞術(shù)檢測聯(lián)合用藥對細胞凋亡的影響藥物作用于H1975細胞24 h后，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果，如圖3所示。單用吉非替尼(1 μmol/L)細胞凋亡率為(4.47±0.28)%，單用ALG-X-012(1 mg/mL)細胞凋亡率為(3.93±0.15)%。兩藥合用后細胞凋亡率為(11.43±0.96)%，相比較于單獨用藥，其凋亡率增加了2.5～2.9倍，凋亡率顯著增(P<0.05)。

3.4Western Bolt檢測細胞相關(guān)蛋白各組給藥后H1975細胞EGFR-PI3k-AKT信號通路相關(guān)蛋白表達比較結(jié)果，如圖4所示。ALG-X-012，吉非替尼以組對p-EGFR、p- AKT、p-mTOR無明顯下調(diào)，與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥顯著下調(diào)p-EGFR、p- AKT、p-mTOR，其可能機制與抑制p- AKT活性，EGFR活化，p-mTOR 活化從而阻斷EGFR/PI3k/AKT通路有關(guān)。

4　討論

吉非替尼(Gefitinib)是第一代可逆性治療NSCLC分子靶向的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，其主要攻擊的靶點是EGFR，EGFR的突變與異常表達引起PI3K/AKT信號通路異常[10]，促進腫瘤細胞的快速增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[11]，是驅(qū)動肺癌發(fā)生和發(fā)展的主要病因之一，因此PI3K/AKT信號通路表達與肺癌發(fā)展密切相關(guān)。研究表明金復(fù)康口服液不僅能夠抑制肺癌的遠處轉(zhuǎn)移，改善肺癌患者生存質(zhì)量，延長生存期，與吉非替尼聯(lián)用后，對PC-9R細胞的增殖抑制影響明顯增強，逆轉(zhuǎn)吉非替尼對PC-9R的耐藥，且對p-EGFR有一定的下調(diào)[12]。ALG-X-012是在金復(fù)康原方的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化而成，本研究探討ALG-X-012聯(lián)用吉非替尼對非小細胞肺癌細胞H1975的影響。

MTT實驗結(jié)果表明，低于5 μmol/L吉非替尼對H1975細胞增殖無明顯抑制作用，濃度為0.0625～16 mg/ml ALG-X-012對H1975細胞無明顯抑制作用。但吉非替尼(1 μmol/L)與ALG-X-012(1 mg/mL)聯(lián)合用藥后，顯著降低了H1975細胞的存活率，比單用1μmol/L吉非替尼組降低約37%，可以看出兩藥聯(lián)用后，增加了吉非替尼對細胞的抑制作用；而后進一步采用劃痕實驗考察聯(lián)合用藥對細胞遷移的影響，與空白組相比，吉非替尼組，ALG-X-012組在12 h和24 h，劃痕寬度與面積均無明顯變化，表明單獨用藥組對H1975細胞遷移無明顯抑制作用。聯(lián)合用藥組經(jīng)過12 h和24 h后，與空白對照組相比，劃痕的寬度與面積有顯著性差異，空白組劃痕寬度為(511.47±31) μm，聯(lián)合用藥組為(719.67±27) μm，可得看出聯(lián)合用藥組對于H1975細胞的遷移有明顯的抑制作用；細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，吉非替尼組與ALG-X-012組在24 h后對H1975細胞凋亡無明顯誘導(dǎo)作用，但當(dāng)吉非替尼聯(lián)合ALG-X-012用藥后，與單獨用藥組比，H1975細胞凋亡率顯著提高約2.5～2.9倍，表明聯(lián)合用藥組能增加吉非替尼對H1975細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。提示AL9G-X-012與吉非替尼聯(lián)用后可增加H9175細胞對吉非替尼的敏感程度，增強其抗腫瘤藥效。

為了探討兩者聯(lián)用可能作用的機制，實驗進一步應(yīng)用Western blot 檢測EGFR-PI3k-AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達。p-EGFR、p-mTOR、p-AKT蛋白都是EGFR-PI3k-AKT信號通路相關(guān)的重要蛋白，p-AKT是PIK3信號通路下游的激酶，在抑制細胞凋亡和促進細胞增殖中有重要影響，p-mTOR參與腫瘤細胞的生長、分化、免疫調(diào)節(jié)，其活化與EGFR-TKI耐藥有直接的關(guān)系。Western blot結(jié)果顯示，空白組、吉非替尼組、ALG-X-012組對p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白并無顯著下調(diào)，聯(lián)合用藥組相比吉非替尼組對p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白的下調(diào)顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。因此ALG-X-012與吉非替尼聯(lián)用對H1975細胞的機制可能與抑制EGFR和p-mTOR的活化有關(guān)。

綜上所述，EGFR-PI3k-AKT信號通路是腫瘤生長的重要通路，它的失調(diào)會促進腫瘤細胞的生長并抑制細胞凋亡。金復(fù)康優(yōu)化方ALG-X-012與吉非替尼的聯(lián)用對非小細胞肺癌H1975細胞有顯著抑制細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞遷移的作用，其機制可能是ALG-X-012阻斷了EGFR-PI3k-AKT信號通路，從而增強吉非替尼抗腫瘤活性。

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