王亞紅,賈穎超

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林 吉林 132022)

茄子性味古寒，有散血瘀、消腫止疼、治療寒熱、祛風(fēng)通絡(luò)和止血等功效.茄子根含有極為豐富的生物活性成分-黃酮類(lèi)化合物[1].黃酮類(lèi)化合物又稱(chēng)生物類(lèi)黃酮，是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類(lèi)化合物[2].黃酮類(lèi)化合物具有一定的藥學(xué)性能，如增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖、降低心肌耗氧量、增加冠狀動(dòng)脈及腦血管流量、消除體內(nèi)自由基、抗氧化、抗衰老等功能[3].此外，天然黃酮類(lèi)化合物因具有相對(duì)安全的特點(diǎn)在食品加工中廣泛用作添加劑[4].在大多數(shù)地區(qū)，茄子根隨意丟棄或焚燒，不但沒(méi)有將資源合理利用，還污染環(huán)境.因此，茄子根中總黃酮的提取對(duì)生產(chǎn)生活有很重要的現(xiàn)實(shí)意義[5].

索氏提取法采用溶劑回流和虹吸原理，連續(xù)提取固體物料，既節(jié)省溶劑又可以提高提取效率[6].本研究用索氏提取器提取茄子根中總黃酮，為其進(jìn)一步分離提純和生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

茄子根飲片購(gòu)于吉林市江城大藥房；試劑主要有無(wú)水乙醇(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水三氯化鋁(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；醋酸鈉(分析純)，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；醋酸(分析純)，天津市福晨化學(xué)試劑廠.

1.2　實(shí)驗(yàn)儀器

FA2204N型電子分析天平，上海箐海儀器有限公司；DNG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；759型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司.

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取干燥至恒重的對(duì)照品蘆丁7.2 mg，用無(wú)水乙醇溶解定容至25 mL容量瓶中，取上述溶液10 mL定容于25 mL容量瓶中，配制成濃度為0.115 2 mg/mL對(duì)照品溶液.

1.3.2供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的茄子根粉末2 g，以60%乙醇為溶媒，液料比為35 mL/g，用索氏提取器提取兩次，提取時(shí)間為3 h，減壓過(guò)濾后，合并兩次提取液，密封備用.

1.3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別移取蘆丁對(duì)照品溶液、供試品溶液各2 mL置10 mL容量瓶中，各加入質(zhì)量濃度為1.34%的三氯化鋁溶液2 mL，pH5.2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液1 mL，充分振搖混合，用60%乙醇定容.40 ℃水浴加熱15 min，以不加對(duì)照品溶液的空白組為對(duì)照，在同一臺(tái)紫外分光光度儀進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)的掃描.

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取蘆丁對(duì)照品溶液1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL分別置于5個(gè)10 mL容量瓶中，各加入質(zhì)量濃度為1.34%的三氯化鋁溶液2 mL，pH5.2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液1 mL，充分振搖混合，用60%乙醇定容.40 ℃水浴加熱15 min，以不加對(duì)照品溶液的空白組為對(duì)照，于398 nm處測(cè)定吸光度[7,8].

1.3.5茄子根總黃酮提取率計(jì)算

移取每次實(shí)驗(yàn)合并所得的提取液適量置于10 mL容量瓶中，按照1.3.4方法測(cè)定吸光度，若結(jié)果超出線性范圍則做稀釋或濃縮處理.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取率，公式如下[9]：

其中w%為茄子根總黃酮提取率，y為吸光度，n為稀釋倍數(shù)，V1為每次實(shí)驗(yàn)合并所得提取液體積，單位為mL.

1.3.6茄子根前處理與提取率關(guān)系

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的24目、50目、65目、80目、100目茄子根粉末2 g，按照1.3.2項(xiàng)方法提取，按照1.3.4項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取率.

1.3.7單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的50目茄子根粉末2 g，分別就乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%)，提取時(shí)間(2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h)，溶媒用量(15 mL/g、25 mL/g、35 mL/g、45 mL/g、55 mL/g)，按照1.3.2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).

1.3.8響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，分別以乙醇濃度、提取時(shí)間、溶媒用量這三個(gè)因素設(shè)計(jì)三水平共計(jì)17次實(shí)驗(yàn)，以總黃酮的提取率為響應(yīng)指標(biāo)確定最佳工藝條件，因素水平如表1[10].

表1　因素水平表

2　結(jié)果與分析

2.1　檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

掃描結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液、供試品溶液的最大吸收峰均出現(xiàn)在398 nm，所以本實(shí)驗(yàn)確定398 nm為測(cè)定波長(zhǎng).

2.2　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=22.156X-0.044 4.R2=0.999 5.結(jié)果表明蘆丁在0.014～0.032 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

2.3　茄子根前處理與提取率關(guān)系

茄子根粉末目數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1.

茄子根粉末目數(shù)圖1　茄子根粉末目數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖1可知，茄子根總黃酮的提取率隨著藥粉目數(shù)的增大先增大后減小，當(dāng)目數(shù)達(dá)到50目時(shí)，茄子根的提取率達(dá)到最大值.確定以50目茄子根粉末為原料完成所有實(shí)驗(yàn)研究.

2.4　單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

乙醇濃度的影響如圖2所示.

乙醇濃度/%圖2　乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

從圖2可以看出，茄子根總黃酮的提取率先隨著乙醇濃度增加而有所提高，當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)處于一個(gè)最高點(diǎn)，隨后提取率隨乙醇濃度增加而下降.確定40%乙醇濃度進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).

2.4.2提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

提取時(shí)間的影響見(jiàn)圖3.

提取時(shí)間/h圖3　提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

從圖3可知，茄子根總黃酮的提取率隨著提取時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到3.5 h的時(shí)候，總黃酮提取率達(dá)到最大值.確定3.5 h進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).

2.4.3溶媒用量對(duì)總黃酮提取率的影響

溶媒用量的影響見(jiàn)圖4.

溶媒用量/(mL/g)圖4　溶媒用量對(duì)總黃酮提取率的影響

從圖4可知，茄子根總黃酮的提取率隨著溶媒用量的增加而增加，當(dāng)溶媒用量為25 mL/g時(shí)，總黃酮提取率最大，隨后提取率開(kāi)始下降.確定25 mL/g進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).

2.5　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.5.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示.

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到總黃酮提取率對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、溶媒用量的二次多項(xiàng)回歸模型，回歸方程為：

Y=0.42+0.016A+0.018B+2.000E-003C-0.012AB+7.500E-004AC+0.02BC-0.035A2-0.039B2-0.053C2.

其中Y為茄子根總黃酮提取率預(yù)測(cè)值，A、B、C分別為上述3個(gè)自變量的編碼值.

2.5.2方差分析與顯著性檢驗(yàn)

方差分析與顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3.

由表3可以看出模型顯著(p<0.005)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有實(shí)際意義的，失擬項(xiàng)是不顯著的(p>0.05)，所以該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)驗(yàn)的擬合度良好且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)合理可靠.模型的R2=0.922 2，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有92.22%來(lái)源于所選自變量，因變量和所選自變量之間的線性關(guān)系顯著，進(jìn)一步說(shuō)明該回歸方程可以替代實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析.模擬的二次項(xiàng)A2、B2、C2均達(dá)到顯著水平，響應(yīng)面模型一次項(xiàng)溶媒用量B達(dá)到顯著水平，表明溶媒用量對(duì)茄子根總黃酮提取的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系.本模型可以得到足夠的響應(yīng)信號(hào)，因此可以用此模型分析和預(yù)測(cè)茄子根總黃酮提取工藝結(jié)果.

表3　回歸模型方差分析

注：P<0.000 1為極顯著，P<0.01為非常顯著，P<0.05為顯著.

2.5.3響應(yīng)面分析

采用Design Expert 8.0.6軟件，將三種因素兩兩進(jìn)行分析比較，根據(jù)回歸方程，各因素間交互作用的響應(yīng)面見(jiàn)圖5～圖7.

乙醇濃度/%

圖5　乙醇濃度與溶媒用量交互作用對(duì)提取率的影響

響應(yīng)曲面反映每?jī)蓚€(gè)影響因素之間的交互作用，考察響應(yīng)面可進(jìn)一步確定溶媒用量對(duì)總黃酮提取率的影響最大，乙醇濃度次之，提取時(shí)間對(duì)其影響相對(duì)較小.等高線的形狀反映交互作用的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素的交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著.

圖5中顯示乙醇濃度與溶媒用量交互作用對(duì)提取率有影響，但不顯著.隨著乙醇濃度的增高，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增高后降低趨勢(shì)；隨著溶媒用量增多，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì).乙醇濃度在40%～45%之間，溶媒用量在20～30 mL/g之間，茄子根總黃酮提取率達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)最大值.

圖6中顯示了乙醇濃度與時(shí)間交互作用對(duì)提取率有影響，但不顯著.隨著乙醇濃度的增高，黃酮提取率呈現(xiàn)先增高后降低趨勢(shì)；隨著時(shí)間的增大，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì).乙醇濃度在40%～45%之間，時(shí)間在3.6～3.8 h之間，茄子根總黃酮提取率達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)最大值.

時(shí)間/h

圖6　乙醇濃度與時(shí)間交互作用對(duì)提取率的影響

圖7中顯示了溶媒用量與時(shí)間交互作用對(duì)提取率有影響，但不顯著.隨著溶媒用量增多，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增高后降低趨勢(shì)；隨著時(shí)間的增大，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì).溶媒用量在20～30 mL/g之間，時(shí)間在3.6～3.8 h之間，茄子根總黃酮提取率達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)最大值.

時(shí)間/h

圖7　溶媒用量與時(shí)間交互作用對(duì)提取率的影響

2.5.4響應(yīng)面最佳條件確定

經(jīng)過(guò)Design Expert分析，得到模型最佳數(shù)據(jù)為乙醇濃度42.20%、溶媒用量25.62 mL/g、提取時(shí)間3.60 h，模型預(yù)測(cè)總黃酮提取率為0.424%.為了具有可操作性，將上述數(shù)據(jù)修正為乙醇濃度42%，溶媒用量26 mL/g，提取時(shí)間3.6 h.

2.5.5模型的驗(yàn)證

為檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的科學(xué)性，按照修正后的最佳條件提取茄子根總黃酮，3次平行實(shí)驗(yàn)提取率分別為0.423%、0.427%、0.425%，平均值為0.425%，RSD值為0.007%.

實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.24%.因此采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的索氏提取茄子根總黃酮的條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠.

3　結(jié)　　論

本研究通過(guò)茄子根前處理與提取率關(guān)系實(shí)驗(yàn)確定茄子根粉末最適宜粒度為50目基礎(chǔ)之上，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了乙醇濃度、提取時(shí)間、溶媒用量對(duì)總黃酮提取率的影響，將乙醇濃度考察范圍定為30～50%，提取時(shí)間考察范圍定為3～4 h、溶媒用量考察范圍定為15～35 mL/g.通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，建立了茄子根總黃酮索氏提取的數(shù)學(xué)模型，模型的決定系數(shù)為0.922 2，方程顯著，擬合良好，可以進(jìn)行實(shí)際預(yù)測(cè)，并最終確定茄子根總黃酮索氏提取最佳工藝條件為：乙醇濃度42%，溶媒用量26 mL/g，提取時(shí)間3.6 h，茄子根粉末目數(shù)50目.3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均提取率為0.425%，和模型預(yù)測(cè)的提取率0.424%相對(duì)誤差0.24%，因此響應(yīng)面法對(duì)茄子根總黃酮提取的優(yōu)化是可行的，優(yōu)化得到的總黃酮提取工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.

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