高傳鵬，劉鈺軍，鄧秀瓊

1.定西市中醫(yī)院，甘肅 定西 743000；2.深圳市平樂骨傷醫(yī)院，廣東 深圳 518500

隨著人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的變化，脂肪肝的發(fā)生率呈逐年增加的趨勢[1～2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脂肪肝與外邪、情志等緊密相關(guān)，病機與肝郁、痰濕、血瘀等有關(guān)。若不及時治療，可發(fā)展為脂肪性肝炎，甚至演變成肝癌，對患者的生存構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]。超氧化物歧化酶(SOD)和總谷胱甘肽(T-GSH)是肝細(xì)胞出現(xiàn)急性損傷修復(fù)的重要組成成分之一，可有效清除自由基、過氧化物，防止細(xì)胞遭受氧化損傷。丙二醛(MDA)可用來判斷脂質(zhì)過氧化損傷程度[4]。肝X受體α(LXR-α)是一種與脂肪肝相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)下游與脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)脂質(zhì)沉積于肝臟中，促進(jìn)脂肪肝發(fā)展[5]。本研究探討中藥清肝方對脂肪肝大鼠脂肪氧化損傷相關(guān)因子及LXR-α的影響，以期為脂肪肝的辨證施治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠60只，清潔級，體質(zhì)量180～220 g，購自廣州必貝特醫(yī)藥技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SYXK(粵)2016-0163，動物批號：05125。將大鼠置于廣東省深圳市平樂骨傷醫(yī)院實驗中心，室溫22℃、相對濕度30%～40%、12 h白晝/12 h黑夜，常規(guī)飼料及飲用水喂養(yǎng)，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥品與試劑 清肝方：生山楂、何首烏各189 g，澤瀉、赤芍、丹參、白芍、黃精各126 g，姜半夏、茯苓、甘草、柴胡各63 g；雙蒸水充分浸泡，水煎，以4層紗布過濾，分別濃縮成0.5、1、2 g/mL 3個濃度的水煎液，消毒，滅菌，4℃保存?zhèn)溆?，中藥飲片由廣東省深圳市平樂骨傷醫(yī)院提供。辛伐他汀(石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20093007)；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、游離脂肪酸(FFA)試劑盒由武漢博士德公司提供；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)由北京博奧森生物工程開發(fā)有限公司提供；總抗氧化能力(T-GSH)、超氧化物歧化酶活性(SOD)、丙二醛(MDA)由上海麥約爾生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 造模與分組 將60只SD大鼠隨機分成正常組、模型組、清肝方低劑量組、清肝方中劑量組、清肝方高劑量組、辛伐他汀組，每組10只。除了正常組外，其余各組采用基礎(chǔ)飼料、2%膽固醇及10%豬油喂養(yǎng)6周，復(fù)制大鼠脂肪肝模型。①模型組：灌胃生理鹽水。②清肝方低劑量組：按5 g/(kg·d)灌胃清肝方；③清肝方中劑量組：按10 g/(kg·d)灌胃清肝方；④清肝方高劑量組：按15 g/(kg·d)灌胃清肝方；⑤辛伐他汀組：將辛伐他汀研成粉末后，配以生理鹽水灌胃，劑量為25.2 mg/(kg·d)；另隨機取10只正常大鼠為正常組。給藥組于造模后第8天開始按等容量灌胃給藥，正常組和模型組同期予等容量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥6周。

1.4 檢測指標(biāo) ①肝組織病理學(xué)檢測：6周后對大鼠禁食，但不禁水16 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，處死大鼠；獲取肝組織，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察大鼠肝臟病理組織學(xué)的改變，確定造模成功。②血脂和肝功能水平：處死大鼠，心臟采血，待血液凝固后1 000 r/min離心15 min，分離血清，置于-20℃冰箱，采用全自動生化分析儀檢測 TG、TC、HDL-C、LDL-C、FFA、ALT、AST。③T-GSH、SOD、MDA水平：用生理鹽水制成10%的肝組織勻漿液，按試劑盒采取ELSIA法檢測。④肝X受體α基因(LXR-α)mRNA表達(dá)：采用Primer 5.0引物軟件設(shè)計熒光引物，引物由上海生物工程有限公司合成，以液氮研磨肝組織，加入300 μL預(yù)冷Trizol混勻，室溫孵育5 min，0.2 mL氯仿處理，振蕩后再放置2～3 min，離心(1 200 r/min)15 min，吸入上清液，0.5 mL異丙醇處理，混勻后放置10 min，4℃下離心10 min，棄上清液，加入1 mL的75%乙醇，充分沉淀后4℃離心(1 000 r/min)5 min，室溫干燥后，焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解；短暫離心后加入5×第一鏈反應(yīng)緩沖液2 μL、Oligo dT引物為 0.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，總RNA為2 μL，采用DEPC水補齊后達(dá)到10 μL，混勻后37℃下放置20 min，85℃下加熱15 min，停止反應(yīng)。采用凝膠分析軟件Gelpro 4.0分析其積分光密度值(IOD)，以目的片段的IOD值/內(nèi)參的IOD值，計算其相對值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件分析，計量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理學(xué)HE染色結(jié)果 見圖1。正常組大鼠肝組織形態(tài)正常，肝小葉完整，肝細(xì)胞索清晰。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞廣泛變性，肝細(xì)胞脂肪變超過75%，腺泡內(nèi)呈點狀壞死。清肝方高劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞明顯濁腫，脂滴存在。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)特征 (×200)

2.2 各組大鼠血脂水平比較 見表1。與正常組比較，模型組大鼠TC、TG、LDL-C和FFA水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，清肝方低、中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠TC、TG、LDL-C和FFA下降，HDL-C升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 各組大鼠血脂水平比較(±s)

表1 各組大鼠血脂水平比較(±s)

與正常組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別正常組模型組清肝方低劑量組清肝方中劑量組清肝方高劑量組辛伐他汀組n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 T C(m m o l/L)1.7 3±0.2 6 6.2 1±0.3 5①6.1 1±0.2 9②5.9 7±0.2 5②4.7 7±0.5 1③4.8 1±0.5 2③T G(m m o l/L)0.8 1±0.0 3 1.1 6±0.2 3①1.1 2±0.2 1②1.0 4±0.1 9②0.8 4±0.0 9③0.8 6±0.0 9③H D L-C(m m o l/L)1.6 9±0.2 9 0.8 1±0.1 5①0.8 7±0.1 7②0.9 2±0.2 2②1.3 1±0.1 7③1.2 8±0.1 6③L D L-C(m m o l/L)0.9 5±0.2 1 2.1 1±0.3 1①2.0 6±0.2 9②1.9 1±0.2 7②1.5 2±0.1 9③1.5 5±0.1 8③F F A(μ m o l/L)1 2 8.5 4±4 0.6 5 3 8 3.2 3±7 6.4 3①3 7 1.0 5±6 6.4 1②3 5 5.2 1±6 1.2 2②2 8 1.3 2±4 1.3 1③2 8 5.0 6±3 9.3 5③

2.3 各組大鼠肝功能比較 見表2。與正常組比較，模型組大鼠ALT和AST明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，清肝方低、中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠ALT和AST明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 各組大鼠肝功能比較(±s) U/L

表2 各組大鼠肝功能比較(±s) U/L

與正常組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別正常組模型組清肝方低劑量組清肝方中劑量組清肝方高劑量組辛伐他汀組n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 A L T 4 0.6 5±1 0.4 3 2 7 7.4 3±5 5.2 3①2 6 8.2 9±4 9.1 7②2 5 5.2 5±4 3.2 6②1 2 1.7 9±2 2.8 5③1 2 5.0 6±2 1.9 3③A S T 8 5.7 6±1 7.5 6 1 5 3.2 3±2 3.2 3①1 4 6.8 8±2 2.4 5②1 4 0.1 2±2 1.4 1②1 0 4.2 7±1 7.9 9③1 0 6.5 8±1 6.8 6③

2.4 各組大鼠氧化損傷指標(biāo)比較 見表3。與正常組比較，模型組大鼠SOD、T-GSH明顯降低，MDA明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，清肝方低、中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠SOD、T-GSH明顯升高，MDA顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表3 各組大鼠氧化損傷指標(biāo)比較(±s)

表3 各組大鼠氧化損傷指標(biāo)比較(±s)

與正常組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別正常組模型組清肝方低劑量組清肝方中劑量組清肝方高劑量組辛伐他汀組n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 S O D(U/m g)2 3 2.5 6±4 5.6 5 1 3 2.5 4±2 5.3 4①1 3 5.4 3±4 0.4 5②1 4 9.1 2±4 1.2 5②1 7 1.6 2±4 3.0 9③1 6 9.8 8±4 1.8 6③M D A(U/m g)5.7 3±0.7 1 9.5 4±4.0 3①8.9 8±2.7 9②8.1 6±2.2 1②7.0 3±1.7 5③7.1 1±1.7 1③T-G S H(μ m o l/L)4 0.6 5±5.4 3 2 3.5 4±4.5 4①2 5.2 6±4.8 8②2 7.2 5±5.1 5②3 3.8 9±5.2 5③3 2.7 1±5.9 3③

2.5 各組大鼠肝組織中LXR-α mRNA表達(dá)比較 見表4。與正常組比較，模型組大鼠LXR-α mRNA明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，清肝方低、中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠LXR-α mRNA明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表4 各組大鼠肝組織中LXR-α mRNA表達(dá)比較(±s)

表4 各組大鼠肝組織中LXR-α mRNA表達(dá)比較(±s)

與正常組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別正常組模型組清肝方低劑量組清肝方中劑量組清肝方高劑量組辛伐他汀組n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 L X R-α m R N A 7 7.5 4±4 4.0 1 2 1 2.5 4±4 3.5 2①2 0 6.8 2±4 0.2 6②1 8 8.9 1±3 0.1 2②1 1 5.6 1±2 5.5 7③1 1 7.7 5±2 2.6 5③

3 討論

脂肪肝是肝細(xì)胞中蓄積過量的脂肪而形成的病理綜合征[6]。脂肪肝的發(fā)生率僅低于病毒性肝炎。脂肪肝是由于肝細(xì)胞的脂肪來源多，且肝臟自身合成脂蛋白、氧化脂肪酸的功能下降，造成脂類物質(zhì)的失衡，進(jìn)而肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性[7]。臨床對于脂肪肝的治療多服用他汀類藥物，辛伐他汀可有效治療高膽固醇血癥，降低低密度脂蛋白膽固醇，具有改善血脂、肝脂的療效，并且肝毒性也較低[8]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脂肪肝可歸屬于痰濁、脅痛等范疇。中藥清肝方成分主要有生山楂、黃精、何首烏、白芍、甘草等[9]。其中，生山楂可以有效調(diào)節(jié)血脂，何首烏發(fā)揮補益精血作用，丹參活血，白芍補血柔肝，甘草可有效調(diào)和諸藥，諸藥共奏疏肝、活血、祛濕的功效，從而降解肝內(nèi)脂肪。

在本研究中，與正常組比較，模型組大鼠的TG、TC、LDL-C、FFA、ALT、AST明顯升高，HDL-C明顯降低，說明了本組研究采取的模型復(fù)制方法對動物的血脂和肝功能造成了明顯影響。與模型組比較，清肝方高、中、低劑量組大鼠的TC、TG、LDL-C、FFA、ALT、AST明顯降低，HDL-C明顯升高，清肝方高劑量組干預(yù)效果與辛伐他汀組基本一致。ALT、AST是評價肝功能的重要指標(biāo)，ALT可判斷肝臟病理損傷程度，AST用于評價肝臟組織的損害程度[10]，說明一定劑量的清肝方對脂肪肝可發(fā)揮改善血脂和肝功能的效果。

MDA是脂質(zhì)過氧化而生成的最終產(chǎn)物，將會造成細(xì)胞腫脹、壞死，進(jìn)而細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，可有效評價脂質(zhì)過氧化的損傷情況[11～12]。SOD、T-GSH是一種抗氧化劑，可清除自由基、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，阻止脂質(zhì)發(fā)生過氧化[13]。本研究中，與正常組比較，模型組大鼠的MDA明顯升高，SOD、T-GSH明顯降低；與模型組比較，清肝方高、中、低劑量組大鼠MDA明顯降低，SOD、T-GSH顯著升高，清肝方高劑量組療效與辛伐他汀組基本一致。說明了一定劑量的清肝方可有效降低MDA，提高SOD、T-GSH含量，有效清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。

LXR-α是脂代謝通路的關(guān)鍵信號因子，LXR-α激活劑TO901317可有效誘導(dǎo)小鼠肝臟的膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP-1c)的表達(dá)水平[14]。在本研究中，與正常組比較，模型組大鼠的LXR-α mRNA明顯升高；與模型組比較，清肝方高劑量組大鼠的LXR-α mRNA明顯降低，與辛伐他汀組的效果基本一致，而清肝方中、低劑量組對LXR-α mRNA改善效果不如高劑量組，提示了一定劑量的清肝方可能通過降低LXR-α mRNA表達(dá)，發(fā)揮相應(yīng)治療作用。

綜上所述，清肝方對脂肪肝動物模型具有較好的改善效果，提高肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的清除能力及降低LXR-α表達(dá)可能是其發(fā)揮治療作用的途徑之一。

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