成　凱，劉進(jìn)平，鄧代信，陳正武，李忠朝，周紹均，牛素貞

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué) 園藝專業(yè)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.貴州省茶葉研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 4.都勻市科技和知識(shí)產(chǎn)權(quán)局， 貴州 都勻 558000； 5.遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院， 貴州 遵義 563000； 6.國(guó)家茶及茶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(貴州)， 貴州 遵義 563000； 7.貴州大學(xué) 茶學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

古茶樹作為初級(jí)茶樹種質(zhì)資源，具有遺傳多樣性豐富、保存和研究?jī)r(jià)值高等特點(diǎn)。古茶樹資源中蘊(yùn)含的許多特異性狀，如高茶多酚、低咖啡堿、高茶氨酸、高抗性基因源、茶黃素形成能力強(qiáng)等可以直接利用，也可以作為突破性育種的材料[1-4]。目前，關(guān)于古茶樹資源的研究主要集中在古茶樹資源的調(diào)查和保護(hù)[5-9]、遺傳多樣性和遺傳育種[10-11]方面，且存在較強(qiáng)的地域性[4]，而針對(duì)古茶樹品質(zhì)的研究較少[12-15]?；ㄇ嗨赜置ㄉ?，是一種廣泛存在于茶葉中的天然色素，具有抗氧化、抗癌、抗炎、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟等多種生理活性[16-17]。目前已知的花青素有20多種，食品中主要有6 種即天竺葵素、矢車菊素、飛燕草素、芍藥色素、矮牽牛色素和錦葵色素[18]。肯尼亞曾報(bào)道，茶葉中的花青素主要是矢車菊素、天竺葵素和飛燕草素、芍藥素和錦葵素[19]；Terahara等[20]從Benibana-cha品種的茶樹花中提取得到3種花青素：矢車菊-3-O-β-D-半乳糖苷、飛燕草-3-O-β-D-半乳糖苷、飛燕草 3-O-B-D-(6-(E)-P-香豆酰)半乳糖苷；費(fèi)旭元[19]采用高效液相色譜法在紫娟烘青綠茶中檢測(cè)到的花青素種類為：天竺葵素-3，5-二葡萄糖苷、矢車菊-3-O-半乳糖苷、天竺葵素。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法，以種植在貴州大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)茶園的4個(gè)古茶樹優(yōu)系為材料，同時(shí)以春梢一芽二葉為研究對(duì)象，分析其矢車菊素的含量，其目的在于篩選出一種適宜檢測(cè)古茶樹矢車菊素的液相色譜條件，為評(píng)價(jià)貴州大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)茶園的4個(gè)古茶樹優(yōu)系花青素含量、探究茶葉花青素積累模式等提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

供試材料為種植于貴州大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)茶園的2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、6號(hào)古茶樹扦插4年生茶樹，同時(shí)以貴州大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)茶園中的福鼎大白茶扦插4年生茶樹作為對(duì)照(CK)。

主要試劑為矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于SK Chemicals)，甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、鹽酸(該4種藥品均為分析純)，乙腈、甲酸、磷酸二氫鉀、磷酸(4種藥品均為色譜純)等。

1.2　儀器與設(shè)備

主要儀器與設(shè)備為濾紙、漏斗、玻璃棒、鐵架臺(tái)、燒杯、容量瓶、微波爐、水浴鍋、三角瓶、分光光度計(jì)、分析天平、電熱恒溫水浴鍋、高效液相色譜儀(日本島津公司的LC-20A)、色譜工作站(日本島津公司)、色譜分析柱(日本島津公司Shimpack VP-ODS 2.1 mm×100 mm、3.0 μm)。

1.3　方法

1.3.1樣品制備

于2015年春季取春稍一芽二葉，材料在250 ℃滾筒殺青機(jī)里殺青，殺青后放入103 ℃干燥箱里干燥40 min，將烘干茶葉磨成粉末，用電子天平精確稱取茶樣粉末3 g，放置于100 mL容量瓶中，加入5%鹽酸-甲醇溶液稀釋，定容至刻度線，搖勻后，移動(dòng)到超聲波提取30 min，使原材料冷卻，冷卻后，進(jìn)行過濾，樣品備用。

1.3.2測(cè)試參數(shù)的確定

流動(dòng)相的篩選：準(zhǔn)確稱取1 mg矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品溶解在1 mL酸性甲醇溶液中，取0.3 mL定容在10 mL的容量瓶中，用酸性甲醇溶液溶解并定容至10 mL。檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm、色譜柱流速1.0 mL·min-1、柱溫40 ℃、進(jìn)樣分析時(shí)間5 min、進(jìn)樣量10 μL，采用不同流動(dòng)相處理以確定測(cè)試參數(shù)。以進(jìn)樣濃度0.15、0.30、0.45、0.60 μg·μL-1為水平坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1不同流動(dòng)相處理

Table1Treatment of different mobile phase

處理Treatment流動(dòng)相AMobilephaseA流動(dòng)相BMobilephaseB流動(dòng)相A/流動(dòng)相BMobilephaseA/MobilephaseB檢測(cè)波長(zhǎng)Detectionwavelength/nm流速Flowvelocity/(mL·min-1)柱溫Columntemperature/℃進(jìn)樣量Injectionvolumn/μL處理1Treatment10.5%甲酸0.5%Formicacid乙腈Acetonitrile1∶95201.04010處理2Treatment2超純水Ultrapurewater甲醇Methanol1∶95201.04010處理3Treatment3超純水Ultrapurewater乙腈Acetonitrile1∶95201.04010處理4Treatment4超純水Ultrapurewater乙腈Acetonitrile9∶15201.04010處理5Treatment5超純水Ultrapurewater甲醇Methanol9∶15201.04010處理6Treatment6超純水Ultrapurewater乙腈Acetonitrile3∶75201.04010

1.3.3數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)整理，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　高效色譜儀流動(dòng)相的選擇優(yōu)化

圖1結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下，矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品中的色譜分析各不相同，但是在處理3的色譜條件下矢車菊素的出峰強(qiáng)度最大，對(duì)稱性最好。

2.2　矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=609.2x+3.086，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.999 1，出峰時(shí)間2.35 min，線性范圍0～0.6 μg·μL-1，說明矢車菊素質(zhì)量濃度與峰面積的線性相關(guān)性較好。

A， 處理1；B， 處理2；C， 處理3；D， 處理4；E， 處理5；F， 處理6。A， Treatment 1; B， Treatment 2; C， Treatment 3; D， Treatment 4; E， Treatment 5; F， Treatment 6.圖1　不同色譜條件對(duì)矢車菊素峰值和對(duì)稱性的影響Fig.1　Effect of different chromategraphic conditions on peak value and symmetry of cyanidin

2.3　茶葉樣品中矢車菊素含量

通過計(jì)算結(jié)果可知，4個(gè)古茶樹優(yōu)系之間存在差異顯著性，其中，古茶4號(hào)的矢車菊素含量最高，古茶2號(hào)的矢車菊素含量最低，且均與對(duì)照福鼎大白茶達(dá)到差異顯著性(圖2)。

不同小寫字母表示處理間在5%水平的差異顯著性(P<0.05)。Bars with different lowercase letters showed significant difference(P<0.05).圖2　茶樣中矢車菊素的含量Fig.2　Cyanidin content of in tea

3　小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采取HPLC法定性定量分析貴州大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)茶園的2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、6號(hào)古茶樹優(yōu)系的矢車菊素的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，古茶4號(hào)的矢車菊素含量最高，古茶3號(hào)矢車菊素含量次之，且均顯著高于對(duì)照福鼎大白茶，而古茶2號(hào)矢車菊素含量較低，顯著低于對(duì)照福鼎大白茶。除定量測(cè)定4個(gè)古茶樹優(yōu)系矢車菊素外，本研究在測(cè)定過程中，根據(jù)篩選出的溶劑以及色譜條件，以出峰的最大強(qiáng)度和對(duì)稱性為依據(jù)，選擇出最合適的分析參數(shù)為檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm、色譜柱流速1.0 mL·min-1、柱溫40 ℃、分析時(shí)間5 min、流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為乙腈，體積比1∶9。

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