趙 濱 ， 陰亞坤 ， 李 軻

（1.河南省直第三人民醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州，450000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州，450000）

瘢痕是促進(jìn)傷口愈合的生理進(jìn)程產(chǎn)物，瘢痕纖維組織修復(fù)過(guò)程中由于創(chuàng)面的不完全張力，可導(dǎo)致瘢痕組織斷裂-再修復(fù)的循環(huán)過(guò)程，形成病理性瘢痕組織[1]。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，相關(guān)研究指出其組織學(xué)特點(diǎn)包括成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖、凋亡受抑制、大量的細(xì)胞外基質(zhì)和膠原纖維排列紊亂等[2]。病理性瘢痕可致使患者皮膚外表美觀(guān)度受損，伴有灼痛瘙癢等，并由于攣縮畸形造成功能障礙[3]，深入研究其形成機(jī)制對(duì)治療病理性瘢痕具有較多積極意義?；诖?，本研究回顧性分析我院行瘢痕切除術(shù)患者96例臨床資料，以探究病理性瘢痕組織中B細(xì)胞白血病2蛋白（Bcl-2）、自殺相關(guān)因子（Fas蛋白）的表達(dá)及意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年6月～2017年6月間行瘢痕切除術(shù)患者96例臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合瘢痕切除術(shù)指征且于我院行手術(shù)者；年齡＞18歲者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他皮膚疾病者；精神心理疾病史者；經(jīng)放射或免疫治療者；病理監(jiān)測(cè)結(jié)果等臨床資料不完整者。根據(jù)切除組織病理檢查結(jié)果分為病理性瘢痕組（n=46）和非病理性瘢痕組（n=50）。對(duì)照組為非病理性瘢痕組患者正常皮膚組織。病理性瘢痕組：男女分別為28例、18例，年齡22～43歲、平均年齡（26.439.83）歲。非病理性瘢痕組：男女分別為27例、23例，年齡20～39歲、平均年齡（25.799.43）歲。2組一般資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方 法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，行連續(xù)切片，一張切片做蘇木精-伊紅（HE）染色，其余做免疫組化染色；均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色。常規(guī)脫蠟后蒸餾水洗5min，置于蒸餾水新鮮配置的3%過(guò)氧化氫室溫孵育15min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，經(jīng)蒸餾水洗3次、每次2min，磷酸緩沖鹽溶液浸泡2次、每次5min；將切片進(jìn)入枸櫞酸鹽緩沖液（PH=6.0），再放入沸騰高壓鍋8min，冷水沖至室溫后孵育30min，蒸餾水洗5min、磷酸緩沖鹽溶液洗2次、每次3min；滴加二抗同種動(dòng)物血清封閉液，室溫孵育10min，滴加一抗工作液，4℃下過(guò)夜，0.01ml磷酸緩沖鹽溶液洗3次、每次5min；滴加即用型生物素標(biāo)記二抗，置37℃中孵育30min，0.01ml磷酸緩沖鹽溶液洗3次、每次5min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白工作液，37℃孵育30min，0.01ml磷酸緩沖鹽溶液洗3次、每次5min；滴加DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色時(shí)間、觀(guān)察顯色反應(yīng)，顯色適度時(shí)以蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染30s，蒸餾水水洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗；梯度酒精脫水后，中性樹(shù)膠封片。

1.3 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

鏡下觀(guān)察切片著色強(qiáng)度及面積進(jìn)行評(píng)分，著色強(qiáng)度0～3分，（0分：無(wú)著色、1分：淡黃色、2分：棕黃色、3分：棕褐色），陽(yáng)性著色面積0～3分（0分：無(wú)著色、1分：著色面積＜1/3、2分：著色面積1/3～2/3、3分：著色面積＜2/3），2項(xiàng)之和≥3分為陽(yáng)性[4]；400倍光鏡下觀(guān)察免疫組化結(jié)果，每例切片隨機(jī)選5個(gè)視野，每視野觀(guān)察100個(gè)細(xì)胞，記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并測(cè)算5個(gè)視野的細(xì)胞平均陽(yáng)性率。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)

比較3組Bcl-2、Fas蛋白陽(yáng)性率及平均陽(yáng)性細(xì)胞率，利用pearson相關(guān)分析Bcl-2、Fas蛋白的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，行t檢驗(yàn)或單因素方差分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以[n(%)]表示，行χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)，線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系分析使用pearson相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組陽(yáng)性率對(duì)比

Bcl-2陽(yáng)性率病理性瘢痕組高于非病理性瘢痕組和對(duì)照組（P＜0.05）、非病理性瘢痕組高于對(duì)照組（P＜0.05），F(xiàn)as陽(yáng)性率病理性瘢痕組低于非病理性瘢痕組和對(duì)照組（P＜0.05）、非病理性瘢痕組低于對(duì)照組（P＜0.05），如表1所示。

2.2 3組平均陽(yáng)性細(xì)胞率對(duì)比

Bcl-2平均陽(yáng)性細(xì)胞率高于非病理性瘢痕組和對(duì)照組（t=9.982、19.393），非病理性瘢痕組高于對(duì)照組（t=12.729），F(xiàn)as平均陽(yáng)性細(xì)胞率低于非病理性瘢痕組和對(duì)照組（t=7.350、24.942）、非病理性瘢痕組低于對(duì)照組（t=14.306），如表2制，所示。

2.3 Bcl-2、as蛋白的相關(guān)性

pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，Bcl-2和Fas呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.684，P=0.000）。

3 討 論

病理性瘢痕的病理基礎(chǔ)是以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞成分過(guò)度增生和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)成分的過(guò)度沉積，而成纖維細(xì)胞調(diào)控增生性瘢痕的形成依賴(lài)分泌的多種細(xì)胞活性成分[5]。減輕患者的不適感并滿(mǎn)足病理性瘢痕患者的審美需求是合理的，激光治療是目前使用較多的治療手段之一[6]，但治療花費(fèi)較多、還具有一定風(fēng)險(xiǎn)。目前治療病理性瘢痕的藥物研究主要針對(duì)其功能異常的成纖維細(xì)胞，通過(guò)直接或間接抑制成纖維細(xì)胞的增殖、侵襲和膠原合成來(lái)阻止疾病進(jìn)展[7]，因此研究調(diào)控成纖維細(xì)胞的相關(guān)因子具有較多積極意義。

表1 3組陽(yáng)性率對(duì)比[n（%）]

表2 3組平均陽(yáng)性細(xì)胞率對(duì)比（xs±，%）

細(xì)胞凋亡收到細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，而凋亡蛋白分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩類(lèi)，Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[8]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Bcl家族在肥厚性瘢痕生成中也起重要作用[9]。本研究結(jié)果顯示，病理性瘢痕組標(biāo)本中Bcl-2陽(yáng)性率和平均陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于非病理性瘢痕組和對(duì)照組，且非病理性瘢痕組高于對(duì)照組，這表明Bcl-2表達(dá)上升可在病理性和非病理性瘢痕形成中起作用。Bcl-2細(xì)胞表達(dá)上升，與Bax蛋白形成二聚體，阻斷細(xì)胞色素C釋放，則成纖維細(xì)胞凋亡受到抑制[10]，使瘢痕中成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖、膠原蛋白過(guò)度累積，促進(jìn)病理性瘢痕發(fā)生。周曙[11]等學(xué)者在其論著中表示，姜黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)比例來(lái)誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡，與本文結(jié)論相互印證。國(guó)外也有學(xué)者使用腫瘤壞死因子α刺激基因-6處理病理性瘢痕后發(fā)現(xiàn)，Bcl-2表達(dá)水平下降，Bax蛋白上升[12]。

Fas/Fas受體系統(tǒng)介導(dǎo)的信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一[13]。Fas受體在正常皮膚及病理性瘢痕成纖維細(xì)胞膜上均有分布，本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)as蛋白在病理性和非病理瘢痕中陽(yáng)性率和平均陽(yáng)性細(xì)胞率均低于正常皮膚，即Fas在瘢痕形成中低表達(dá)。同時(shí)，Bcl-2和Fas蛋白呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明凋亡途徑和抗凋亡途徑兩者在病理性瘢痕形成機(jī)制中均有影響，且兩因子相互關(guān)聯(lián)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。病理性瘢痕相關(guān)研究從細(xì)胞因子、蛋白組學(xué)等領(lǐng)域進(jìn)行探討[14]，以期從不同層面中分析病理性瘢痕形成機(jī)制，為指導(dǎo)臨床治療和藥物研究提供新思路。病理性瘢痕中主要是成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，李云飛[15]等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，病理性瘢痕中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等促血管生成細(xì)胞生長(zhǎng)因子也呈高表達(dá)，說(shuō)明血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖也參與病理性瘢痕形成。

本研究雖獲得一定結(jié)論，但受觀(guān)察時(shí)間和樣本量影響仍存在一定局限性。病理性瘢痕組織形成明顯受Bcl-2及Fas蛋白影響，同時(shí)也受促血管生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的影響，因此相關(guān)研究者可進(jìn)一步探究影響病理性瘢痕不同因子間的相關(guān)關(guān)系，以期進(jìn)一步找到消除病理性瘢痕的關(guān)鍵因素。調(diào)節(jié)Bcl-2及Fas蛋白表達(dá)水平是消除病理性瘢痕的有效機(jī)同時(shí)Bcl-2在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中也起一定作用[16]，相關(guān)藥物研究也可以從此入手，以推動(dòng)臨床新藥研究。

綜上所述，病理性瘢痕中Bcl-2表達(dá)水平高于非病理性瘢痕和正常皮膚，F(xiàn)as蛋白則在病理性瘢痕中低表達(dá)。

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