侯曉艷 ，姜 露 ，葉 麟，2，申光輝，黎杉珊，羅擎英，吳賀君，張志清*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.瀘州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川 瀘州 646000)

我國農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問題十分普遍，部分農(nóng)藥殘存量遠(yuǎn)超國家標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明蔬菜和水果中農(nóng)藥殘留以有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥為主[1]。但由于農(nóng)藥在化學(xué)防治中不可替代的地位和作用[2]，其使用不能夠完全被禁止，當(dāng)前最為關(guān)鍵的是加強(qiáng)對果蔬等農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測，同時采取有效措施禁止檢測不合格的產(chǎn)品上市[3]。

酶抑制法是一種快速檢測農(nóng)藥殘留的方法，雖不能定量地檢測農(nóng)殘，但方便省時，能夠滿足市場需求，我國已將該方法列入國家標(biāo)準(zhǔn)[4]。其檢測所用酶源主要來自動物及昆蟲體內(nèi)提取的膽堿酯酶和從植物中提取的植物酯酶[5-10]。膽堿酯酶來源有限、價格偏高，且保存期短，嚴(yán)重制約了其在快速檢測中的應(yīng)用[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),植物酯酶應(yīng)用于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測的效果較好[12]，且來源廣泛、成本低、提取方便，其對農(nóng)藥的敏感性不遜于膽堿酯酶[13]。目前應(yīng)用較多的植物酯酶主要從小麥或小麥面粉及植物種子中提取，而以小麥加工的副產(chǎn)物——麥麩為酶源的研究鮮見報道。

本課題組前期從麥麩中成功分離純化得到較高單位酶活的麥麩酯酶，并對其酶學(xué)性質(zhì)等進(jìn)行了系統(tǒng)研究[14]。本文在前期研究基礎(chǔ)上，通過測定農(nóng)藥抑制酶的動力學(xué)常數(shù)(Ki、Ka、K2)及半抑制濃度(IC50)揭示麥麩酯酶的動力學(xué)特性。研究結(jié)果可為麥麩酯酶應(yīng)用于農(nóng)藥檢測提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：麥麩(雅安市售)。

氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：葉蟬散(≥99.8%)、丁硫克百威(1.00 mg/mL)、西維因(≥99.8%)，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；有機(jī)磷類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：甲基對硫磷(1.00 mg/mL)、敵敵畏(1.00 mg/mL)、樂果(1.00 mg/mL)，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；α-乙酸萘酯：上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；固蘭B鹽：西化儀(北京)科技有限公司。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液：6種農(nóng)藥全部配制成10 mg/L的儲備液(丙酮)，將敵敵畏、西維因、葉蟬散用0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)稀釋成0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液；樂果、甲基對硫磷用0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)稀釋成0.50、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液；丁硫克百威用0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)稀釋成0.10、0.16、0.25、0.50、0.72、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 儀器設(shè)備

FW-100高速萬能粉碎機(jī)(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)；759s紫外可見分光光度儀(上海棱光技術(shù)有限公司)；LGJ-10冷凍干燥機(jī)(北京松源華興生物技術(shù)有限公司)；ST16R冷凍離心機(jī)(美國賽默飛世爾科技有限公司)；GC-2010 氣相色譜儀(日本島津公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1麥麩酯酶的提取及相關(guān)指標(biāo)的測定麥麩酯酶的提取參照文獻(xiàn)[15]的方法。

麥麩酯酶單位酶活的測定參照文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行，并按公式(1)計算：

(1)

式中:EAs為麥麩酯酶的單位酶活(U/mL，將每分鐘催化得到1 nmolα-萘酚所需的酶量定義為1U)；k為α-萘酚溶液(pH 7.2)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；OD540 nm為540 nm處樣品的吸光度；V0為反應(yīng)液總體積(mL)；V為加入的酶液體積(mL)；V1為原酶液總體積(mL)。

麥麩酯酶抑制率的測定參考文獻(xiàn)[15]方法，并稍作修改。實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)體系為：將0.25 mL麥麩酯酶加入4.25 mL農(nóng)藥中并混合均勻，于35 ℃恒溫水浴反應(yīng)30 min后，加入0.25 mLα-乙酸萘酯溶液，置于40 ℃恒溫水浴5 min，加入0.25 mL固蘭B鹽和0.25 mL表面活性劑并搖勻，最后加入0.25 mL鹽酸溶液，搖勻，測定吸光度。對照組中，以磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)代替農(nóng)藥，空白對照為未加α-乙酸萘酯溶液的反應(yīng)體系，酶活抑制率公式：

(2)

式中，OD0為對照組吸光度；OD1為實(shí)驗(yàn)組吸光度。

1.3.2動力學(xué)常數(shù)(Ki、Ka、K2)的測定參考文獻(xiàn)[16]方法并修改如下：將實(shí)驗(yàn)分為對照組和測試組，分別取0.25 mL麥麩酯酶溶液加入兩支15 mL試管中，在測試組試管中加入4.25 mL抑制劑(不同濃度的農(nóng)藥溶液)。對照組以磷酸鹽緩沖液代替農(nóng)藥溶液，35 ℃水浴平衡，根據(jù)抑制劑濃度定時取樣，測定麥麩酯酶抑制率。通過改變抑制劑濃度、取樣間隔時間，以酶活和時間作圖確定各農(nóng)藥與酶作用的雙分子反應(yīng)速率常數(shù)(Ki)、解離常數(shù)(Ka)和磷?；?氨基甲?；?常數(shù)(K2)。

由于目前對有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制植物酯酶的動力學(xué)機(jī)制尚未有研究報道，故本文以乙酰膽堿酯酶的抑制動力學(xué)理論為假設(shè)進(jìn)行研究，主要反應(yīng)過程如式(3)所示：

(3)

式中，E為自由酶，AX是帶有基團(tuán)X的有機(jī)磷酯或氨基甲酸鹽，EAX為可逆復(fù)合物，EA是共價的磷酸化(氨基甲酰化)酶，X為解離基團(tuán)，Ka為反應(yīng)物和復(fù)合體間的解離常數(shù)，用來衡量酶和反應(yīng)物結(jié)合能力強(qiáng)弱，其大小由分子結(jié)構(gòu)特征決定，K2是磷?；虬被柞；乃俾食?shù)，Ki為雙分子反應(yīng)速率常數(shù)，其值為K2/Ka。

(4)

(5)

Ka=K2/Ki

(6)

式中，[I]為農(nóng)藥濃度，(e)為經(jīng)抑制后酶的活性，E為對照組酶活。當(dāng)農(nóng)藥固定為某一濃度時，求出農(nóng)藥與酶作用不同時間的ln[(e)/E]，以ln[(e)/E]對時間t作圖，線性擬合即得某一濃度下農(nóng)藥的Kapp。以不同濃度下1/Kapp與農(nóng)藥濃度的倒數(shù)1/[I]作圖，線性擬合，截距的倒數(shù)即為K2,斜率的倒數(shù)即為Ki，根據(jù)式(6)計算Ka。

1.3.3IC50值的測定分別取0.25 mL麥麩酯酶溶液加入兩支15 mL試管中，按濃度從高到低依次取4.25 mL不同濃度的抑制劑(以pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液配制的農(nóng)藥)加入測試組試管中。同時，在對照組試管中加入4.25 mL pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液，35 ℃水浴平衡30 min后測定麥麩酯酶抑制率。

E為對照組酶活的吸光度；e為農(nóng)藥抑制麥麩酯酶后剩余酶活的吸光度；H為酶活的百分抑制率，i為農(nóng)藥濃度，則：

H=[1-(e/E)]×100%

(7)

(8)

將lgi對lg(it)作圖，當(dāng)lg(it)=0時，對應(yīng)的i即為IC50。

1.3.4麥麩酯酶抑制法在果蔬農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用利用制備的麥麩酯酶抽樣檢測本地農(nóng)貿(mào)市場中常見果蔬的農(nóng)藥殘留情況，陽性樣品采用氣相色譜法驗(yàn)證。

按GB/T 5009.218-2008[17]方法進(jìn)行有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的提取和凈化。

氣相色譜檢測條件[18]：色譜柱ZB-5(30 mm×0.32 mm×0.25 μm)，分流比1∶50；載氣流速(N2)：10.0 mL/min；H2：30.0 mL/min；空氣：100 mL/min。程序升溫:150 ℃保溫3 min，以8 ℃/min升溫至 250 ℃，凈化5 min。

1.3.5數(shù)據(jù)處理所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并利用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 農(nóng)藥抑制麥麩酯酶動力學(xué)常數(shù)

表1 有機(jī)磷農(nóng)藥與麥麩酯酶作用的Kapp及r2值Table 1 The Kapp and r2 values of organophosphorus pesticide and wheat bran esterase

表2 各有機(jī)磷農(nóng)藥的動力學(xué)常數(shù)Table 2 The values of kinetic constants of organophosphorus pesticide

表3 氨基甲酸酯類農(nóng)藥與麥麩酯酶作用的Kapp及r2值

表4 氨基甲酸酯類農(nóng)藥的動力學(xué)常數(shù)Table 4 Kinetic constants of carbamate pesticides

2.1.1有機(jī)磷農(nóng)藥抑制麥麩酯酶的動力學(xué)常數(shù)根據(jù)“1.3.2”動力學(xué)常數(shù)的求解方法，計算3種有機(jī)磷農(nóng)藥與麥麩酯酶作用的雙分子反應(yīng)速率常數(shù)(Ki)。

以敵敵畏、樂果和甲基對硫磷在不同濃度下的ln(e/E)值與時間擬合直線，其斜率為-Kapp，敵敵畏、樂果和甲基對硫磷不同濃度所對應(yīng)的Kapp及r2如表1所示。

以表1中農(nóng)藥的濃度與其對應(yīng)的Kapp分別作圖，得到3種有機(jī)磷農(nóng)藥的Ki、Ka、K2值，結(jié)果如表2所示。

在生態(tài)毒理學(xué)研究中，通常以雙分子速率常數(shù)(Ki)來評價酯酶對農(nóng)藥的敏感性，Ki值越大，說明農(nóng)藥的抑制作用越強(qiáng)，或者酶的敏感性越高[19]。由表2可知，3種有機(jī)磷農(nóng)藥的雙分子速率常數(shù)Ki的大小順序?yàn)椋簲硵澄?甲基對硫磷>樂果，且敵敵畏的Ki值分別是甲基對硫磷的34倍，樂果的68倍，這表明麥麩酯酶對敵敵畏的敏感性高于甲基對硫磷，而對樂果的敏感性最低。麥麩酯酶對不同有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性不同，主要與農(nóng)藥生物活性關(guān)系密切的取代基有關(guān)，取代基在其結(jié)構(gòu)中的位置不同，活性也不同[20-21]。實(shí)驗(yàn)中有機(jī)磷農(nóng)藥與麥麩酯酶作用的解離常數(shù)Ka大小依次為：樂果>甲基對硫磷>敵敵畏，說明敵敵畏與麥麩酯酶的親和力最強(qiáng)，其與麥麩酯酶形成復(fù)合體的能力約為甲基對硫磷的58倍，樂果的122倍。抑制劑(農(nóng)藥)的疏水性以及供電性對解離常數(shù)Ka值有較大影響，若農(nóng)藥的疏水性和供電性弱，與酯酶的結(jié)合松散，則親和力小[22-23]。磷?；?shù)K2的大小順序依次為：樂果>甲基對硫磷>敵敵畏，說明樂果與麥麩酯酶生成的中間體最易磷?；?/p>

2.1.2氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制麥麩酯酶的動力學(xué)常數(shù)根據(jù)“1.3.2”方法，計算3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥與麥麩酯酶作用的雙分子反應(yīng)速率常數(shù)。

以不同濃度的葉蟬散、西維因和丁硫克百威的ln(e/E)值隨時間的變化進(jìn)行擬合，其直線斜率即為-Kapp值，葉蟬散、西維因、丁硫克百威各個濃度對應(yīng)的Kapp及r2見表3。

用表3中各農(nóng)藥的Kapp和其對應(yīng)的濃度分別作圖，得到3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的Ki、Ka、K2值，結(jié)果見表4。

由上述結(jié)果可知，不同種類氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制麥麩酯酶的動力學(xué)常數(shù)不同。由表4可知，3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥與麥麩酯酶作用的雙分子速率常數(shù)Ki大小依次為：葉蟬散>西維因>丁硫克百威，且葉蟬散的Ki值約為西維因的1.27倍，丁硫克百威的2倍，這說明麥麩酯酶對葉蟬散的敏感性高于西維因，而對丁硫克百威的敏感性最低。實(shí)驗(yàn)中不同氨基甲酸酯類農(nóng)藥與麥麩酯酶作用的Ka值大小依次為：丁硫克百威>西維因>葉蟬散，說明葉蟬散與麥麩酯酶的結(jié)合能力最強(qiáng)。表4數(shù)據(jù)表明，葉蟬散與麥麩酯酶形成復(fù)合體的能力約為西維因的1.5倍、丁硫克百威的2倍。實(shí)驗(yàn)中不同氨基甲酸酯類農(nóng)藥與麥麩酯酶作用的K2值大小依次為：西維因>丁硫克百威>葉蟬散，但其值均在0.05左右。從表2和表4中可以看到葉蟬散對麥麩酯酶的親和常數(shù)Ka低于敵敵畏，說明葉蟬散對麥麩酯酶的親和能力小于敵敵畏對麥麩酯酶的親和力。而相同濃度下葉蟬散抑制反應(yīng)所需平衡時間較長(敵敵畏需30 min，葉蟬散則需35 min)。

農(nóng)藥與酯酶親和能力越高，其雙分子速率常數(shù)越大，麥麩酯酶對其敏感性越高，而3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的氨基甲?；芰ο嗖畈淮螅f明麥麩酯酶對農(nóng)藥敏感性大小與農(nóng)藥與麥麩酯酶的親和力強(qiáng)弱關(guān)系密切，而與磷?；桶被柞；饔脧?qiáng)弱的相關(guān)性較小，該結(jié)果與張佳佳等[24]的研究結(jié)果一致。推測其原因可能是，與酶親和力低的化合物，擴(kuò)散到酶活性中心的速率較慢，而該過程恰恰是底物與酶反應(yīng)的限速步驟，從而導(dǎo)致酶與其反應(yīng)的雙分子速率常數(shù)較小。Apilux等[25]認(rèn)為有機(jī)磷農(nóng)藥的磷?；约鞍被姿狨ヮ愞r(nóng)藥的氨基甲?；饔门c乙酰膽堿酯酶的敏感性關(guān)系不大，Storm等[26]也指出化合物與乙酰膽堿酯酶之間的親和力是一個非常重要的因素。

2.1.3農(nóng)藥抑制麥麩酯酶的半數(shù)抑制濃度(IC50) 根據(jù)百分抑制率H，求得lg(it)和lgi，再以lg(it)為橫坐標(biāo)，lgi為縱坐標(biāo)作圖，線性擬合得到一條直線。令lg(it)=0，則對應(yīng)的i即為IC50。

根據(jù)圖1，計算各農(nóng)藥對麥麩酯酶的IC50值，結(jié)果分別是敵敵畏0.176 mg/L，樂果2.583 mg/L，甲基對硫磷1.754 mg/L，葉蟬散0.489 mg/L，西維因0.799 mg/L，丁硫克百威2.035 mg/L。3種有機(jī)磷農(nóng)藥對麥麩酯酶的IC50值大小順序?yàn)椋簶饭?甲基對硫磷>敵敵畏，說明敵敵畏對麥麩酯酶的敏感性高于樂果與甲基對硫磷。3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對麥麩酯酶的IC50值大小順序?yàn)椋憾×蚩税偻?西維因>葉蟬散，說明葉蟬散對麥麩酯酶的敏感性高于丁硫克百威和西維因,與前述6種農(nóng)藥抑制麥麩酯酶的動力學(xué)常數(shù)推算的敏感性趨勢完全一致。

2.2 麥麩酯酶抑制法在果蔬農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用

為驗(yàn)證麥麩酯酶抑制法檢測農(nóng)藥的有效性，從雅安市農(nóng)貿(mào)市場購買常見的13種蔬菜和水果樣品，每個樣品檢測2次。根據(jù)姜露等[27]的方法進(jìn)行初篩，對于酶活抑制率高于10%的樣品采用氣相色譜法進(jìn)行定量檢測，結(jié)果見表5。由表5可知，萵筍葉、四季豆和葡萄的檢測結(jié)果(酶活抑制率)高于10%。再用氣相色譜對這3個樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)葡萄中含有樂果，而其他2個樣品均未檢出具體的農(nóng)藥種類。此外，由于蘋果樣品提取液放置時間過久會發(fā)生褐變反應(yīng)而影響檢測結(jié)果，故本方法不能用于對蘋果的農(nóng)藥殘留檢測?？梢?，樣品前處理方法也是農(nóng)殘分析檢測的關(guān)鍵步驟。

表5 新鮮果蔬農(nóng)殘檢出情況Table 5 Detection of pesticide residues in fresh fruits and vegetables

“+” represents positive，“-”represents negative and “——”represents undetectable

3 結(jié) 論

本研究以乙酰膽堿酯酶的抑制動力學(xué)理論為假設(shè)進(jìn)行了麥麩酯酶抑制動力學(xué)特性的研究。各農(nóng)藥與麥麩酯酶作用的動力學(xué)常數(shù)與IC50值表明，各農(nóng)藥對麥麩酯酶具有選擇性抑制作用。麥麩酯酶對3種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性大小依次為：敵敵畏>甲基對硫磷>樂果，對3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性大小依次為：葉蟬散>西維因>丁硫克百威。為驗(yàn)證麥麩酯酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留的可行性，從農(nóng)貿(mào)市場購買果蔬進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示酶活抑制率高于10%的樣品為萵筍葉、四季豆和葡萄，且葡萄中為樂果殘留，說明本方法具有一定實(shí)用性。此外本研究僅是通過求解農(nóng)藥與麥麩酯酶作用的動力學(xué)常數(shù)來解釋其對麥麩酯酶的抑制作用強(qiáng)弱，而抑制作用的類型、抑制機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

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