郭常川，孫 華，石 峰*，邢 晟，張迅杰，李 可，賀美蓮，姜 瑋,3*

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101;2.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250012;3.山東大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，山東 濟南 250100)

消化不良是一種臨床癥候群，主要由胃動力障礙所引起，包括胃蠕動差的胃輕癱和食道反流病，是一種發(fā)病人群很廣的常見疾病。近年來，市面上出現(xiàn)很多針對消化不良癥狀的聲稱“純天然”、“無化學(xué)添加”的生化藥品、中成藥或保健品。然而，此類產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，一些不法分子為片面追求治療效果、獲取經(jīng)濟暴利，擅自在其中添加化學(xué)藥品，不僅違反了《藥品管理法》和《食品安全法》的規(guī)定，還嚴(yán)重危及廣大人民群眾的身體健康。中成藥、生化藥品或保健品若在說明書中明確注明含有某種化學(xué)成分，則符合法律法規(guī)；若未注明卻被檢出，則為非法添加。因此，為嚴(yán)厲打擊非法添加行為，保證人民群眾的食品和用藥安全，亟需開發(fā)快速、準(zhǔn)確、高靈敏、高選擇性的用于非法添加消化類化學(xué)藥物的快速篩查方法。

當(dāng)前，已報道的非法添加檢測手段以液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)[1-3]為主，也有關(guān)于高效液相色譜法(HPLC)[4]、薄層色譜法(TLC)-表面增強拉曼(SERS)聯(lián)用法[5-6]、膠束電動色譜法[7]的報道。Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀(Orbitrap HRMS)是最新的高分辨質(zhì)譜技術(shù)，分辨率可達(dá)1 000 000以上，質(zhì)量精度可達(dá)0.1～1 ppm[8]，可進(jìn)行高精度的目標(biāo)物或非目標(biāo)物的篩查。近年來，Orbitrap 高分辨質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用日益增多，已用于食品安全[9-10]、藥品安全[11]、中成藥成分分析[12]、藥物動力學(xué)[13]、蛋白組學(xué)[14]、代謝組學(xué)[15]研究等領(lǐng)域。

本文首次將超高效液相色譜-Orbitrap高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-HRMS)技術(shù)用于消化類化學(xué)藥物非法添加的快速篩查、鑒定和定量研究。通過Full MS/dd-MS2(Data-dependent MS2) 模式，在一個分析周期(10 min)內(nèi)完成對樣品的高精度一級、二級掃描，得到準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和準(zhǔn)確碎片離子信息，同時對潛在的陽性樣品進(jìn)行定量分析。本方法具有快速、準(zhǔn)確、高靈敏度、高選擇性的特點，為打擊非法添加行為提供了新手段、新技術(shù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Q Exactive PlusTM超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)包括Ultimate 3000液相泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱以及Orbitrap高分辨質(zhì)譜部分(Thermofisher Scientific,德國)；XCalibur 4.0軟件(Thermofisher Scientific,美國)用以質(zhì)譜儀控制和數(shù)據(jù)處理；Mettler XS205電子天平(Mettler Toledo，瑞士)；KQ-300 GDV溫控超聲儀(昆山舒美,中國)；Sigma 3K15高速冷凍離心機(Sigma-Aldrich，德國)；IKA Vortex3旋渦混勻器(IKA，德國)。色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18(2.1 mm×100 mm,3 μm,Thermofisher Scientific，美國)。

對照品左卡尼汀、法莫替丁、西咪替丁、鹽酸雷尼替丁、消旋山莨菪堿、甲氧氯普胺、奧美拉唑、雷貝拉唑鈉、泮托拉唑鈉、多潘立酮、西沙比利和枸櫞酸莫沙必利均購自中檢院，伊托必利購自加拿大TRC公司；HPLC級甲醇、乙腈以及超純水均購自Fisher公司(美國)，HPLC級甲酸、甲酸銨、乙酸銨購自ACS恩科化學(xué)公司(美國)；樣品來源：156批生化藥品(復(fù)方胃蛋白酶顆粒)來自2017年國家評價性抽驗檢品，38批中成藥、43批保健品來自山東省食品藥品監(jiān)督管理局或山東省各市、縣食品藥品監(jiān)督管理局抽樣。將未檢出以上13種成分的10批樣品混合均勻，作為陰性樣品基質(zhì)。10批陰性樣品編號分別為YC201700004,YC201700025,YC201700039,YC201700040,YC201700055,YC201700057,YC201700058,YC201700068,YC201700114,YC201700117。

1.2 溶液的制備

1.2.1對照品溶液的制備精密稱取各對照品適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(質(zhì)量濃度為200 mg/L)。向空白基質(zhì)中加標(biāo)準(zhǔn)品，配成相當(dāng)于實際樣品質(zhì)量濃度為8、40、200、400、800 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液和QC(質(zhì)量控制)溶液。

1.2.2供試品溶液的制備取供試品約0.5 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加提取溶劑甲醇-水(50∶50，體積比)適量，超聲提取15 min，冷卻至室溫，加提取溶劑定容至刻度，上清液過濾膜，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

1.3.1色譜條件色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18(2.1 mm ×100 mm,3 μm)。流動相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～1.0 min，5%B；1.0～5.0 min，5%～85%B；5.0～7.5 min，85%B；7.5～7.6 min，85%～5%B；7.6～10.0 min，5%B。流速：300 μL·min-1；柱溫：40 ℃；自動進(jìn)樣器溫度：20 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件Q ExactiveTM質(zhì)譜系統(tǒng)配有HESI離子源，采用正離子模式，噴霧電壓為3.0 kV,毛細(xì)管和噴霧溫度分別為350 ℃和250 ℃。鞘氣和輔助氣壓力分別設(shè)為40、15 arb，S-lens RF電壓為50 V。噴霧氣和碰撞氣均為氮氣。使用校正溶液(含咖啡因、四肽MRFA和Ultramark 1621的混合溶液)每3 d校正1次質(zhì)量軸。掃描方式采用正離子Full MS/dd-MS2模式。Full MS一級全掃描范圍為m/z100～1 000，自動增益控制AGC、最大注入時間IT分別設(shè)為1.0e6和100 ms；dd-MS2數(shù)據(jù)依賴的二級掃描AGC設(shè)為2.0e5,最大IT設(shè)為50 ms,分離窗口設(shè)為1.0m/z。各化合物的歸一化碰撞能量設(shè)為20%、40%、60%。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的建立

考慮到13種化合物的極性差異較大，故選擇甲醇-水(體積比50∶50)作為提取溶劑，結(jié)果表明其對13種化合物均有較高的提取效率，且濾液潔凈，無需進(jìn)一步凈化即可直接進(jìn)樣，簡化了樣品前處理。

由于13種化合物結(jié)構(gòu)中均含有較多的N原子，正離子質(zhì)譜掃描模式下響應(yīng)高，因此選擇正離子模式。分別將13種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液流動注入質(zhì)譜儀進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，獲得相應(yīng)的準(zhǔn)分子離子峰，輸入至方法設(shè)置中。各化合物二級質(zhì)譜掃描的碰撞能量統(tǒng)一設(shè)為20%、40%、60%，得到的二級質(zhì)譜圖是在3種碰撞能量下二級質(zhì)譜圖的疊加，有效避免了采用單一碰撞能量可能導(dǎo)致的不同儀器間重現(xiàn)性差的情況。在建立的LC-MS聯(lián)用方法中，掃描方式選擇正離子Full MS/dd-MS2模式，此模式包含一次一級全掃描和一次數(shù)據(jù)依賴的二級掃描。一級質(zhì)譜全掃描采用70 000 FWHM分辨率，確保得到高分辨質(zhì)譜準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)；二級質(zhì)譜掃描采用17 500 FWHM，保證高分辨掃描的同時加快掃描速度。

對比了甲醇-水和乙腈-水混合體系作為流動相的效果，并在水相中分別添加了少量甲酸、甲酸銨、乙酸銨等。結(jié)果表明，乙腈-0.1%甲酸水體系能得到最佳的分離效果，獲得最佳的色譜峰形和較高的靈敏度，因此選擇乙腈-0.1%甲酸水體系作為流動相，并采用“1.3.1”所述梯度洗脫程序。

2.2 專屬性

稱取陰性樣品適量，按“1.2.2”方法處理得到空白基質(zhì)溶液，進(jìn)樣5 μL分析，空白基質(zhì)溶液的提取離子色譜圖顯示，各化合物保留時間處未出現(xiàn)干擾峰或干擾峰很小(遠(yuǎn)低于檢出限)，對定量分析沒有影響，專屬性強。單次測定在10 min內(nèi)即可完成，分析效率高，尤其適用于高通量篩查。另取200 μg/L的QC溶液進(jìn)樣5 μL分析，記錄色譜圖(圖1)。

化合物的保留時間、準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息如表1所示。理論質(zhì)量數(shù)與實際測得的質(zhì)量數(shù)相對偏差越小，表明篩查結(jié)果的可信程度越高。表1中13種分析物的實測和理論質(zhì)量數(shù)偏差均不超過3.08 ppm，顯示了Orbitrap HRMS高度可靠的質(zhì)量精度。代表性化合物雷尼替丁的二級質(zhì)譜圖及裂解機理如圖2所示，二級質(zhì)譜碎片離子輔助確證化合物的存在，裂解機理闡明了主要碎片離子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及裂解途徑。

表1 消化類藥物的保留時間和準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測定Table 1 Retention time and accurate mass of digestive system drugs

圖1 QC溶液(200 μg/L)的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of digestive drugs in 200 μg/L spike solutionthe noted numbers were the same as those in Table 1

2.3 檢出限

逐級稀釋QC溶液并進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，按照3倍信噪比計算檢出限。結(jié)果表明各化合物的檢出限均為1.0 μg/L。

圖2 雷尼替丁的二級質(zhì)譜圖(A)以及碎片離子m/z 176.048 8(B)與m/z 270.090 7及m/z 125.005 6(C)的裂解機理Fig.2 MS2 mass spectra(A) and fragmention mechanisms of fragment ions m/z 176.048 8(B)，m/z 270.090 7 and m/z 125.005 6(C)

2.4 線性范圍與定量下限

按“1.2.1”配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣5 μL測定峰面積。以峰面積(y)對標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(x，μg/L)擬合校正曲線，建立回歸方程。結(jié)果表明，13種化合物的峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，線性范圍均為8.0～800 μg/L，相關(guān)系數(shù)(r)為0.998 5～1.000 0(表2)。以線性范圍最低點作為定量下限，13種化合物的定量下限均為8.0 μg/L。

2.5 回收率、準(zhǔn)確度與精密度

分別精密移取對照品儲備液10 μL、陰性供試品0.5 g，置于10 mL容量瓶中，加提取溶劑適量，超聲提取15 min，冷卻至室溫，加提取溶劑定容至刻度，上清液過濾膜，取續(xù)濾液即得供試品溶液(質(zhì)量濃度約為200 μg/L)，平行制備6份。進(jìn)樣，按擬定方法測定回收率，計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)?；厥章势骄涤糜谠u價準(zhǔn)確度，RSD值用于評價精密度，實驗結(jié)果見表2，13種化合物的回收率為94.6%～106.2%，RSD為1.2%～2.9%。

表2 13種消化類化學(xué)藥物的回歸方程，相關(guān)系數(shù)和回收率Table 2 Regression equation,correlation coefficient(r) and recovery of digestive system drug

2.6 基質(zhì)效應(yīng)與穩(wěn)定性

取200 μg/L的QC溶液和200 μg/L的純?nèi)軇φ掌啡芤海謩e進(jìn)樣，計算響應(yīng)值百分比，即為基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明13種化合物的基質(zhì)效應(yīng)均在92.3%～105.6%之間，表明空白基質(zhì)對化合物響應(yīng)影響很小。

用空白基質(zhì)配制200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在1、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，以各化合物的提取離子峰面積為指標(biāo)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度與實際濃度的比值(穩(wěn)定性)在94.5%～102.8%之間，由此可見配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 實際樣品分析

將建立的高分辨質(zhì)譜法用于156批生化藥品、38批中成藥、43批保健品中非法添加消化類化學(xué)藥物的篩查。比較供試品和對照品的提取離子色譜圖、一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜，若供試品某成分的保留時間、一級質(zhì)譜準(zhǔn)確質(zhì)量、碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量均與對照品一致，則判定該成分為非法添加物。

經(jīng)篩查發(fā)現(xiàn)，156批生化藥品均未檢出左卡尼汀等13種化學(xué)藥物，而5批中成藥中檢出西咪替丁(含量為1.4～17.9 mg/g)，3批保健品中檢出多潘立酮(含量8.61～14.3 mg/g)，代表性陽性樣品(檢出多潘立酮)圖譜見圖3所示。以上結(jié)果表明消化類化學(xué)藥物非法添加在中成藥和保健品中較為突出。另一方面，156批生化藥品均未檢出非法成分，可能與其來源是正規(guī)藥品企業(yè)有關(guān)。以上結(jié)果表明本文所建立的高通量HRMS法具有良好的可靠性。

圖3 代表性陽性樣品YW201708461的提取離子色譜圖(A)、一級質(zhì)譜圖(B)和二級質(zhì)譜圖(C)Fig.3 Extracted ion chromatogram(A),MS(B) and MS2(C) spectra of digestive drugs in representative positive sample YW201708461

3 結(jié) 論

本研究建立了一種快速篩查非法添加消化類化學(xué)藥物的方法，可在10 min 內(nèi)同時測定13種消化類藥物。該法選擇性好、靈敏度高、快速簡便、可操作性強、準(zhǔn)確可靠，極大地提高了檢測效率，適用于生化藥品、中成藥及保健品非法添加檢測，已用于日常檢測工作中，為監(jiān)管相關(guān)非法添加提供了有力的技術(shù)支持。

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