劉 鐵，劉德龍，魏永巨

(河北師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

藤絡(luò)寧膠囊是由丁公藤、羌活、獨活、防己、延胡索、丹參等組成的復(fù)方制劑，具有疏風(fēng)散寒、除濕通絡(luò)的功用，用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬寒濕瘀阻證[1]。而東莨菪內(nèi)酯作為處方中君藥丁公藤的主要有效成分之一,具有鎮(zhèn)痛及抗炎等作用[2-7],故測定其含量具有實際意義。目前，測定藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯含量的方法只有高效液相色譜法(HPLC)[8]。國標[1]中采用高效液相色譜梯度洗脫，分析過程耗時較長。

實驗研究表明，東莨菪內(nèi)酯有強熒光性質(zhì)，而熒光方法具有靈敏度高、測試簡單快速的優(yōu)點，但是若測試組分與共存組分的光譜重疊時選擇性較差，化學(xué)計量學(xué)中二階校正方法的“二階優(yōu)勢”可以彌補該缺點進行定量分析。解析三維熒光矩陣有效的二階校正方法主要包括平行因子分析法(PARAFAC)、三線性分解(ATLD)及其衍生方法(交替懲罰三線性分解法APTLD，自加權(quán)交替三線性分解法SWATLD)，以及基于潛變量的殘差雙線性分解的偏最小二乘法(包括Unfolded partial least squares coupled to residual bilinearization(U-PLS/RBL)和Multi-way partial least squares coupled to residual bilinearization(N-PLS/RBL))[9]。前兩類解析方法既能獲得分析體系的定性信息(激發(fā)光譜和發(fā)射光譜)，又能進行定量分析[10-12]，而基于潛變量的偏最小二乘法則只能獲得定量分析結(jié)果。但有一些文獻報道發(fā)現(xiàn)，U-PLS/RBL和N-PLS/RBL在解析組分之間或者組分與背景之間嚴重重疊及存在內(nèi)濾光效應(yīng)等的復(fù)雜光譜體系時，能夠給出更好的定量分析結(jié)果[13-19]。目前尚未見利用二階校正方法U-PLS/RBL解析三維熒光測定藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯含量的報道。

本文首先研究了東莨菪內(nèi)酯的熒光性質(zhì)及最佳實驗條件，選擇最佳測定波長范圍后，用U-PLS/RBL解析合成樣確定了方法的可靠性，然后用于實際樣品藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯的定量分析。為了驗證方法的可靠性，用HPLC方法進行了確證。

1 U-PLS/RBL算法原理

首先測定一系列校正樣和預(yù)測樣的三維熒光光譜矩陣，然后按照如下步驟進行計算。

第一步校正：即在校正樣的濃度和光譜數(shù)據(jù)之間建立PLS模型。先將測定的每個校正樣的三維熒光矩陣向量化(圖1左半部分)，即將每個三維熒光矩陣Xi(J,K)轉(zhuǎn)化為向量xi(J×K,1)，其中i=1，2，…，I,I為校正樣個數(shù)，J和K分別為激發(fā)和發(fā)射波長個數(shù)，之后將所有向量排成矩陣形式X(J×K,I)。然后用X(J×K,I)與校正樣中的濃度向量y(I× 1)進行PLS建模，得到兩個載荷矩陣P(JK×A)、W(JK×A)及回歸系數(shù)向量v(A× 1),A為利用基于去一法的交叉驗證法得到的潛因子數(shù)[20]。v用于估計待測樣中相應(yīng)組分的濃度。

第二步預(yù)測：如果待測樣中不含其它未知成分，則按照如下公式準確估計待測樣中相應(yīng)組分的濃度。

(1)

tu=(WTP)-1WTvec(Xu)

(2)

其中，tu為待測樣向潛變量空間的投影得分向量，vec(Xu)為待測樣矩陣的向量化形式。

如果待測樣中含有其它未知成分，由式(2)計算的tu不適合計算待測樣中的組分濃度，表現(xiàn)為PLS預(yù)測殘差遠大于儀器噪聲。此時按照基于主成分分析的殘差雙線性分解法(RBL)對背景信號進行扣除[9]，公式為(圖1右半部分)：

Xu=reshape(PtRBL)+BRBLTRBLT+ERBL

(3)

上式說明樣本數(shù)據(jù)由兩部分構(gòu)成，一部分為校正樣組分的信號，另一部分則來自試樣中某些潛在的干擾組分。reshape表示將向量轉(zhuǎn)化為矩陣，ERBL表示誤差矩陣，BRBLTRBLT表示對殘差矩陣(Xu-reshape(PtRBL))進行主成分分析后的矩陣乘積(主成分數(shù)=Nunx)。

對式(3)中ERBL的模進行極小化(P保持不變，只改變tRBL)，得到最佳的tRBL，將tRBL代入式(1)可得到扣除背景信號后的真實濃度。詳細的原理和算法見文獻[9]。U-PLS/RBL解析過程如圖1所示[9]。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計(日本日立公司，用1 cm石英比色皿掃描激發(fā)-發(fā)射三維熒光光譜)；激發(fā)波長：310～420 nm，發(fā)射波長：400～550 nm。狹縫寬度為5.0/5.0 nm，掃描速度為1 200 nm/min。

安捷倫1260高效液相色譜儀(配FLD檢測器)；分析天平(0.000 01 g)；pH酸度計(美國Orion公司，Orion868)。

圖1 U-PLS/RBL解析過程Fig.1 Scheme illustrating how U-PLS/RBL works for second-order data three typical calibration samples(of a possibly much larger calibration set) are shown at the left,from which the unfolding operation leads to the XPLS calibration data matrix；the latter is processed with U-PLS and submitted,together with the test sample data X test,to RBL for separating the contribution of the potential interferents,yielding accurate analyte prediction

東莨菪內(nèi)酯(上海源葉生物科技有限公司)：精確稱取1.39 mg東莨菪內(nèi)酯標準品，用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，配成55.6 mg/L的操作液，在4 ℃冰箱避光保存。

藤絡(luò)寧膠囊(購于上海天貓國大藥房旗艦店，生產(chǎn)廠家：吉林省通化博祥藥業(yè)股份有限公司)：取出藤絡(luò)寧膠囊內(nèi)的藥粉，準確稱取0.980 0 g。甲醇浸泡超聲1 h后，搖勻、過濾，并將濾液轉(zhuǎn)至50 mL棕色容量瓶，用甲醇定容，得到19.6 g/L的操作液，置于冰箱4 ℃避光保存。

甲醇(色譜純)；磷酸(分析純)；BR緩沖溶液(0.4 mol/L，pH 9.0)；實驗所用其他試劑均為分析純，實驗用水為自制二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1合成樣的測定取一系列10 mL容量瓶，加入2.00 mL BR緩沖溶液、東莨菪內(nèi)酯溶液和一定量的甲醇，用二次蒸餾水定容后混合均勻。其中7個校正集溶液東莨菪內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.014 7、0.029 4、0.044 1、0.058 8、0.073 5、0.088 2、0.102 9 mg/L；配制6個確證樣，其中東莨菪內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.022 05、0.036 75、0.051 45、0.066 15、0.080 85、0.095 55 mg/L。

2.2.2藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯含量的測定取一系列10 mL容量瓶，加入2.00 mL BR緩沖溶液、東莨菪內(nèi)酯以及適量藤絡(luò)寧膠囊提取液，用二次蒸餾水定容后混合均勻，進行三維熒光掃描。

其中1～7號為校正集，校正樣中東莨菪內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為0.014 7、0.029 4、0.044 1、0.058 8、0.073 5、0.088 2、0.102 9 mg/L。8～12號為樣品集，其中含有一定濃度的藤絡(luò)寧膠囊提取液。

2.2.3回收率實驗1～7號為校正集，濃度同上。8～12號為只有藤絡(luò)寧提取液的樣品。13～17號瓶在藤絡(luò)寧膠囊提取液基礎(chǔ)上，再加入一定量的東莨菪內(nèi)酯標準品。

2.2.4色譜法測定實驗安捷倫1260高效液相色譜儀，F(xiàn)LD檢測器。以ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)為色譜柱,流動相為甲醇-水(含0.2%磷酸)(30∶70，體積比),柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為：激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長460 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 東莨菪內(nèi)酯的熒光光譜性質(zhì)與影響因素

圖2A為東莨菪內(nèi)酯的三維熒光等高線圖，可知東莨菪內(nèi)酯的最大激發(fā)波長為375 nm，最大發(fā)射波長為460 nm。圖2B為藤絡(luò)寧膠囊的三維熒光等高線圖，可知除了東莨菪內(nèi)酯的光譜外，藤絡(luò)寧膠囊的基體成分在此波長范圍內(nèi)含有與之嚴重重疊的高強度光譜信號，利用普通熒光法難于準確測定。故本文應(yīng)用二階校正U-PLS/RBL方法解析三維熒光光譜，以“數(shù)學(xué)分離”代替“化學(xué)分離”。

為了獲得穩(wěn)定和準確的分析結(jié)果，考察了溶液條件對光譜的影響。實驗結(jié)果表明，東莨菪內(nèi)酯在pH 7.83～11.53范圍內(nèi)熒光強度高且穩(wěn)定，因此實驗選取pH 9.0為最佳酸度條件。甲醇用量在0.1%～10%范圍基本無影響，實驗選擇甲醇用量低于10%。實驗結(jié)果表明，東莨菪內(nèi)酯的質(zhì)量濃度在0.014 7～0.102 9 mg/L范圍內(nèi)與熒光強度呈線性關(guān)系。

Nominal(mg/L)Predicted(mg/L)Recovery(%)0 022050 0215697 80 036750 0331290 10 051450 0490595 30 066150 06787102 60 080850 08385103 70 095550 09704101 6Meanrecovery(%)98 5

3.2 合成樣的濃度解析

利用校正樣進行U-PLS/RBL建模后，可對合成樣進行定量分析，來驗證方法的可靠性。表1為U-PLS/RBL對合成樣中東莨菪內(nèi)酯的定量解析結(jié)果。計算得平均回收率為98.5%，說明方法可靠。

3.3 U-PLS/RBL法解析藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯含量與回收率

應(yīng)用U-PLS/RBL首先需確定模型中的主因子數(shù)，圖3為去一法得到的U-PLS/RBL的交叉驗證CV圖及真實濃度與預(yù)測濃度的關(guān)系曲線。從圖3可知，對于東莨菪內(nèi)酯的最佳因子數(shù)為1，關(guān)系曲線的相關(guān)系數(shù)為0.998，說明體系中只有1個熒光信號，這與實際情況一致。U-PLS/RBL的第二步是確定待測樣中的干擾組分數(shù)，考察了U-PLS/RBL估計的光譜殘差與背景組分數(shù)的變化情況，當(dāng)Nunx=0時，即假定沒有干擾背景，殘差約為700，遠大于儀器本身的噪音，說明體系中含有未知干擾組分。當(dāng)背景組分≥1時，殘差強度很低且接近儀器噪音，所以確定背景組分數(shù)Nunx=1。

然后利用RBL估計背景組分的激發(fā)和發(fā)射光譜，即對殘差矩陣(Xu-reshape(PtRBL))進行主成分分析BRBLTRBLT后，取BRBL和TRBL矩陣的第一列。

在確定最佳因子數(shù)和背景因子數(shù)后，計算出扣除背景干擾后的藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯的平均含量為0.058 9%(表2)。以色譜法測定值為標準，計算得U-PLS/RBL法解析東莨菪內(nèi)酯的相對誤差為3.16%，說明本方法準確。

No．ConcentrationofTengluoningcapsule(mg/L)Predictedconcentrationofscopoletin(mg/L)Contentofscopoletin(%)P158 80 034400 0585P258 80 035040 0596P358 80 034090 0580P458 80 034180 0581P558 80 035470 0603Averagecontent(%)--0 0589Relativeerrors(%)?--3 16

*the relative errors were obtained by comparing the content calculated by U-PLS/RBL with the result determined by HPLC method

用U-PLS/RBL法解析得到藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯的平均回收率為100.4%，說明本方法的結(jié)果可靠。

圖4 東莨菪內(nèi)酯(a)和藤絡(luò)寧膠囊(b)的HPLC圖Fig. 4 Liquid chromatograms of scopoletin(a)and Tengluoning capsule sample(b)a： 4 μL scopoletin solution(55.6 mg/L)；b ：5 μL Tengluoning capsule solution(19.6 g/L)

3.4 高效液相色譜法驗證

在選定的最佳條件下，東莨菪內(nèi)酯的保留時間為8.7 min左右(圖4a)。以保留時間8.7 min的峰面積積分值(Y)為縱坐標,東莨菪內(nèi)酯進樣量(X,μg)為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程：Y=102.8+1.735×104X，r=0.999 8，說明東莨菪內(nèi)酯在0.029 4～0.147 μg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密吸取對照品溶液4 μL與藤絡(luò)寧膠囊樣品溶液5 μL,注入高效液相色譜儀,依上述色譜條件進行分離(圖4b),外標法計算含量。在東莨菪內(nèi)酯的保留時間8.7 min處，根據(jù)回歸方程計算得到藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯的平均含量為0.057 1%(n=5,RSD=1.5%)。這與U-PLS/RBL熒光方法測得結(jié)果0.058 9%一致，證明了二階校正方法的可靠性。

4 結(jié) 論

本文借助于熒光光譜的高靈敏性及化學(xué)計量學(xué)二階校正方法的高選擇性，成功地測定了藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯的含量，與色譜法相比，本方法操作簡便，綠色環(huán)保且費用較低，適合復(fù)方中藥體系中有效成分含量的測定，是一種有應(yīng)用潛力的方法。

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