盧煜 賈立昕 張文美 杜杰 解軍

急性心肌梗死是由冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死[1-2］。心臟重構(gòu)對心肌梗死遠期預(yù)后具有重要意義，巨噬細胞參與心肌梗死后心臟重構(gòu)的全過程[3］。在不同刺激下，巨噬細胞可分化為M1型(經(jīng)典活化型)和M2型(替代活化型)型兩種表型[4］發(fā)揮不同的作用：M1型巨噬細胞主要發(fā)揮促炎/殺菌等作用，M2型巨噬細胞則主要表現(xiàn)為抑炎及促修復(fù)等作用[5］。但轉(zhuǎn)錄因子IRF5是巨噬細胞極化的主要調(diào)節(jié)因子[6-7］，外源性IRF5可以上調(diào)M1型或下調(diào)M2型巨噬細胞表型標(biāo)記物的表達[8］，但是IRF5是否參與心肌梗死后心臟重構(gòu)的作用和機制尚不完全清楚。本研究通過構(gòu)建小鼠心肌梗死模型，以及體外缺氧/復(fù)氧刺激小鼠骨髓來源巨噬細胞研究IRF5對小鼠心肌梗死后心臟重構(gòu)的影響及其可能的作用機制。

材料與方法

1.實驗動物與分組 實驗所用8周齡，雄性，C57BL/6J小鼠，全部購買自華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于北京市心肺血管疾病研究所SPF級動物房。將30只，8周齡，雄性小鼠，隨機分為兩組：假手術(shù)組(n=15)和心肌梗死手術(shù)組(n=15)。

2.小鼠心肌梗死模型 用1%～2%異氟烷和氧氣混合氣體麻醉小鼠，在第四肋間間隙經(jīng)開胸擠出心臟后，用6-0尼龍單絲縫線永久性結(jié)扎冠狀動脈左前降支，用4-0線縫合胸腔，等待小鼠自然蘇醒。假手術(shù)組不結(jié)扎冠狀動脈前降支，其余操作與觀察組一致。心肌梗死模型構(gòu)建由專業(yè)人員在同一地點完成，保證模型復(fù)制的一致性。

3.小鼠心功能檢測 心肌梗死后7d利用Vevo 2100 High Resolution Imaging System進行超聲心動圖檢測。將小鼠麻醉后仰臥位固定小鼠，心率維持在450～550次/min，在二維模式下獲得胸骨旁長軸和心室中短軸圖像，記錄乳頭肌水平的M型軌跡。使用Visual Sonics Vevo 2100軟件離線進行圖像分析。

4.心臟組織病理切片制備及染色 小鼠心肌梗死7d后，用含肝素的0.9%氯化鈉溶液灌注心臟，去除心臟內(nèi)血液，用10%甲醛固定后用石蠟包埋，每隔5μm切片。根據(jù)制造商(雷根公司)產(chǎn)品說明書進行Masson染色，檢測心臟纖維化水平。免疫組化染色是將石蠟切片(5μm)脫蠟并抗原修復(fù)后用5%BSA封閉然后用一抗 IRF5(ab33478，Abcam)、MAC-2(sc20157， Santa Cruz Biotechnology)4℃孵育過夜。次日用二抗(anti-mouse IgG)與一抗反應(yīng)，常溫孵育1h。所有圖像用NIS-Elements BR 3.0軟件進行分析。

5.小鼠骨髓來源巨噬細胞提取及處理 從8周齡，雄性C57BL/6J小鼠的股骨和脛骨中分離出骨髓，過70μm尼龍篩網(wǎng)過濾器，1 500rpm，5min離心后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，加入集落刺激因子M-CSF(Pepro Tech)，在37℃含5%二氧化碳和95%氧氣的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細胞是采用 LipofectamineTMiMAX轉(zhuǎn)染試劑將50nM的IRF5 siRNA或control siRNA轉(zhuǎn)染至巨噬細胞。缺氧/復(fù)氧刺激是將細胞在37℃含5%二氧化碳和無氧氣條件下培養(yǎng)8h，然后在常氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h。

6.實時熒光定量PCR 用Trizol試劑(Invitrogen)從小鼠心臟組織及體外培養(yǎng)的細胞中提取總RNA，每份樣品用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)將2μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后每份樣品取1μL cDNA用10μL SYBR Green PCR Master Mix和1μmol/L primers進行擴增。實時熒光定量PCR用CFX-96實時定量PCR儀進行檢測，實驗使用相關(guān)引物序列如下：IRF5，上游 5'-GGTCAACGGGGAAAAGAA ACT-3'，下游 5'-CATCCACCCCTTCAGTGTACT-3'；iNOS，上游 5'-GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA-3'，下游 5'-GTGGACGGGTCGATGTCAC-3'；IL-1β，上游 5'-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3'，下游5'-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3'；IL-6，上游 5'-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3'，下游 5'-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3'；GAPDH，上 游 5'-CCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGA-3'，下游 5'-TTGAAGTCACAGGAGACAACCTGG-3'。

7.流式細胞術(shù) 假手術(shù)組和心肌梗死小鼠心臟組織炎癥細胞浸潤水平通過流式細胞術(shù)來檢測。取兩組小鼠心臟組織，切碎，用collagenase II和 Dispase II在37℃條件下消化30min。實驗使用的相關(guān)抗體包括：PerCP-Cy5.5抗小鼠CD45.2、PE抗小鼠F4/80、Alexa APC抗小鼠 CD11b、FITC抗小鼠CD206。

8.統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用GraphPad-Prism 7.0進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.心肌梗死后小鼠存活情況和心功能變化 取30只，8周齡，雄性，C57BL/6J小鼠，隨機分為假手術(shù)組(n=15)和心肌梗死手術(shù)組(n=15)。統(tǒng)計兩組小鼠存活率：假手術(shù)組15只小鼠全部存活，存活率100%(15/15)；心肌梗死組分別在第3天死亡1只、第5天和6天各死亡2只，存活率66.7%(10/15)，心肌梗死組小鼠存活率明顯低于假手術(shù)組(圖1A)。利用Vevo 2100 High Resolution Imaging System進行超聲心動圖檢測，從表1結(jié)果可見：假手術(shù)組和心肌梗死組小鼠室間隔(IVS)、LVIDD、LVIDS、左心室收縮期心室后壁厚度(LVPWS)、EF和縮短分?jǐn)?shù)(FS)均有明顯差異(P＜0.05)。由表2結(jié)果可見：與假手術(shù)組相比，心肌梗死術(shù)后小鼠體質(zhì)量無明顯差異，HW/BW明顯增加[(5.31±0.17)vs.(7.25±0.73)mg/g，P＜0.05］。 以上結(jié)果表明：心肌梗死術(shù)后7d小鼠存活率降低，心功能降低，心臟結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變。

表1 兩組小鼠超聲心動圖測定結(jié)果(ˉ±s)

表1 兩組小鼠超聲心動圖測定結(jié)果(ˉ±s)

項目 Sham(n=15) MI(n=15)IVSd/mm 0.99±0.08 0.85±0.29 IVSs/mm 1.50±0.10 1.03±0.22*LVID d/mm 3.47±0.21 4.36±0.91*LVID s/mm 2.08±0.21 3.83±1.03*LVPW d/mm 0.80±0.09 0.77±0.16 LVPW s/mm 1.17±0.19 0.92±0.18*LVEF/% 72.72±3.55 29.77±6.63*LVFS/% 41.53±2.64 14.63±5.44*LV Mass(Corrected)/g 91.34±2.98 108±18.03

表2 兩組小鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量測定結(jié)果(ˉ±s)

表2 兩組小鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量測定結(jié)果(ˉ±s)

項目 Sham(n=15) MI(n=15)BW/g 27.30±0.99 26.66±0.82 HW/BW/(mg/g) 5.31±0.17 7.25±0.73*

2.心肌梗死后小鼠心臟纖維化加重 心肌梗死7天后，用0.9%氯化鈉溶液進行灌流后進行病理檢測。通過Masson染色觀察心臟纖維化水平，統(tǒng)計結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，心肌梗死組小鼠心臟纖維化水平明顯增加[(0.90±0.29)%vs.(24.54±5.43)%］(圖1B)。

3.心肌梗死后心臟組織巨噬細胞表型分析 首先我們對假手術(shù)組和心肌梗死術(shù)后7天小鼠心臟組織進行了流式細胞術(shù)檢測，結(jié)果表明：與假手術(shù)組相比，心肌梗死組小鼠心臟組織CD45+白細胞[(1.90±0.53)vs.(10.05±0.44)%］以及 CD45+CD11b+F4/80+巨噬細胞[(0.77±0.21)vs.(7.70±1.68)%］浸潤明顯增多，并且 CD45+CD11b+F4/80+CD206-M1型巨噬細胞[(0.43±1.52)vs.(4.47±0.45)%］以及 CD45+CD11b+F4/80+CD206+M2巨噬細胞[(0.33±0.06)vs.(3.13±0.60)%］也明顯增加(圖2A)。通過MAC2免疫組化染色進一步說明心肌梗死后巨噬細胞浸潤增加[(2.25±1.89)vs.(96.5±7.90)%］(圖2B)。 接下來我們通過實時熒光定量PCR檢測了心肌梗死7天后心臟組織中M1型巨噬細胞標(biāo)志物iNOS、IL-1β、IL-6的表達情況，統(tǒng)計結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，心肌梗死后M1型巨噬細胞標(biāo)記物表達均明顯增加(圖2C)。以上結(jié)果表明：小鼠心肌梗死術(shù)后7d，心臟組織炎癥細胞浸潤增加，M1型巨噬細胞浸潤增加。

圖1 心肌梗死對小鼠存活率及心臟纖維化的影響 A：與假手術(shù)組相比，心肌梗死7天小鼠存活率明顯降低；B：Masson染色評價假手術(shù)組和心肌梗死7天小鼠心臟纖維化水平。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

圖2 心肌梗死后心臟組織炎癥細胞浸潤情況 A：流式細胞術(shù)檢測假手術(shù)組和心肌梗死7天小鼠心臟組織CD45+白細胞、CD45+CD11b+F4/80+巨噬細胞、CD45+CD11b+F4/80+CD206-M1型巨噬細胞、CD45+CD11b+F4/80+CD206+M2巨噬細胞數(shù)占總細胞數(shù)比例；B：免疫組化染色檢測假手術(shù)組和心肌梗死組小鼠IRF5表達；C：使用實時熒光定量PCR檢測M1型巨噬細胞標(biāo)志物mRNA表達水平。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

4.心肌梗死后心臟組織IRF5表達升高 為了進一步探索心肌梗死引起M1型巨噬細胞增多的分子機制，我們利用免疫組化染色和實時熒光定量PCR檢測了心肌梗死后7d心臟組織中IRF5表達水平，結(jié)果表明心肌梗死后 IRF5蛋白表達水平[(2.67±2.08)vs.(76±9.54)%］和RNA表達水平[(1.01±0.18)vs.(12.91±1.34)%］均明顯升高(圖3)。

5.體外缺氧/復(fù)氧刺激促進M1型巨噬細胞極化與IRF5表達 我們利用體外缺氧/復(fù)氧刺激構(gòu)建巨噬細胞缺氧/復(fù)氧模型，通過實時熒光定量PCR檢測M1型巨噬細胞標(biāo)志物iNOS、IL-1β、IL-6以及IRF5表達，結(jié)果表明，與常氧假手術(shù)組相比，缺氧/復(fù)氧刺激后M1型巨噬細胞標(biāo)志物表達均明顯增加，并且IRF5表達增加[(0.97±0.04)vs.1.28±0.13)%］(圖4)。

6.體外抑制IRF5可以降低缺氧/復(fù)氧刺激引起的M1巨噬細胞極化 為了進一步探索IRF5與M1型巨噬細胞之間的關(guān)系，我們首先檢測了IRF5在巨噬細胞中的基因沉默效率，siIRF5處理C57BL/6J小鼠骨髓來源巨噬細胞后，IRF5的mRNA表達水平降低70%(圖5A)。接下來我們利用siIRF5處理C57BL/6J小鼠骨髓來源巨噬細胞，缺氧/復(fù)氧處理后利用實時熒光定量PCR檢測M1型巨噬細胞標(biāo)志物(iNOS，IL-1β，IL-6)表達，結(jié)果顯示siIRF5轉(zhuǎn)染組中M1型巨噬細胞標(biāo)志物表達水平與假手術(shù)組相比均明顯降低(圖5B)。以上結(jié)果表明：抑制IRF5可以降低缺氧/復(fù)氧刺激引起的M1巨噬細胞極化。

討 論

心肌梗死后導(dǎo)致的心臟重構(gòu)最終會引起心力衰竭等嚴(yán)重后果[9］，隨著醫(yī)療水平的不斷發(fā)展，急性心肌梗死患者早期死亡率明顯降低，但是梗死晚期不良的心臟重構(gòu)，是心肌梗死后心衰等不良預(yù)后的重要病理基礎(chǔ)[10］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在心肌梗死后心臟重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用[11］，巨噬細胞是重要的天然免疫細胞，主要通過吞噬細胞碎片、壞死細胞[12］，以及直接分泌生長因子或細胞因子等方式參與成纖維細胞激活與膠原產(chǎn)生等過程[13-14］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，心肌梗死手術(shù)組小鼠心功能顯著降低，心臟炎癥細胞浸潤明顯高于假手術(shù)組，心臟纖維化面積較假手術(shù)組明顯增大。提示心肌梗死后炎癥因子表達增加，導(dǎo)致心臟炎癥和心臟纖維化的加重，惡化心肌梗死后的心臟重構(gòu)。

圖3 心肌梗死后心臟組織IRF5表達水平升高 A：免疫組化染色檢測假手術(shù)組和心肌梗死組小鼠心臟組織IRF5表達；B：實時熒光定量PCR檢測IRF5表達水平。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

圖4 體外缺氧/復(fù)氧刺激促進M1型巨噬細胞極化以及IRF5表達水平 A：缺氧/復(fù)氧刺激后，利用實時熒光定量PCR檢測IRF5在mRNA水平的表達；B：缺氧/復(fù)氧刺激后，利用實時熒光定量PCR檢測M1型巨噬細胞標(biāo)志物在mRNA水平的表達。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

圖5 體外抑制IRF5可以降低缺氧/復(fù)氧刺激引起的M1巨噬細胞極化 A：Realtime-PCR法檢測siCON和siIRF5處理后的WT小鼠骨髓巨噬細胞IRF5表達水平；B：利用si CON和si IRF5處理WT小鼠骨髓巨噬細胞，缺氧/復(fù)氧刺激后，利用realtime-PCR法檢測M1型巨噬細胞標(biāo)志物iNOS、IL-1β、IL-6表達。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

巨噬細胞在不同刺激下分化為M1(經(jīng)典活化)型和M2(替代活化)型，其中以分泌促炎因子為主，發(fā)揮促炎作用的巨噬細胞稱為M1型巨噬細胞，其表面標(biāo)志物有：iNOS， IL-1β，IL-6，HLA-DR，CD197等，巨噬細胞在脂多糖、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ等刺激因子作用下會極化為具有宿主免疫功能的M1型巨噬細胞。在炎癥反應(yīng)后期發(fā)揮抗炎作用并促進組織修復(fù)及纖維化的巨噬細胞為M2型巨噬細胞，常見的 M2巨噬細胞表面標(biāo)志物有：Arg1，CD206， TGF-β等，巨噬細胞在 IL-4、IL-13、M-CSF和TGF-β等作用下向M2型極化[15-16］。M1型和M2型巨噬細胞與心肌梗死后炎癥反應(yīng)和心臟重構(gòu)有密切關(guān)系。M1型巨噬細胞會促進炎癥反應(yīng)，加重組織損傷，M2型巨噬細胞發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)并且促進瘢痕形成的作用。Hu等研究發(fā)現(xiàn)在小鼠心肌梗死模型中，清道夫受體A缺陷使M1型巨噬細胞極化增加，炎癥因子分泌增多，心功能惡化，心室擴張[17］。Pooja等報道指出Caveolin-1敲除通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路促進M2型巨噬細胞激活加劇小鼠心肌梗死后心肌間質(zhì)纖維化[18］。Mira等研究表明在小鼠心肌梗死后，IL-10治療可以增加M2型心臟巨噬細胞極化，減少炎癥，增加傷口愈合，防止MI后不良的心臟重構(gòu)[19］。與上述報道一致，我們的研究中發(fā)現(xiàn)小鼠心肌梗死后心臟組織中M1型巨噬細胞表面標(biāo)志物表達明顯增加，心功能惡化，并且在體外缺氧/復(fù)氧刺激小鼠骨髓巨噬細胞同樣發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細胞標(biāo)志物(iNOS、IL-1β、IL-6)表達的增加。以上結(jié)果表明巨噬細胞極化在心肌梗死后炎癥反應(yīng)和心臟重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。

巨噬細胞的不同分化影響心臟重構(gòu)及遠期心功能，但其分化調(diào)控機制仍不完全明確。有報道表明，LPS刺激骨髓來源巨噬細胞使其向M1型分化，這些巨噬細胞的IRF5 mRNA和蛋白高度表達，并分泌促炎細胞因子，并且在抗原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型中同樣證明IRF5是M1型巨噬細胞極化的主要調(diào)節(jié)因子，可以被用作炎癥巨噬細胞的可靠標(biāo)志物[20］。在脊髓損傷小鼠模型中，siRNA介導(dǎo)的IRF5基因敲除導(dǎo)致 M1巨噬細胞標(biāo)志物表達減少[21］。但在心肌梗死后的心臟重構(gòu)中，IRF5是否參與調(diào)節(jié)巨噬細胞分化及重構(gòu)過程并不清楚。我們的結(jié)果表明，在小鼠心肌梗死以及體外缺氧/復(fù)氧刺激后，M1型巨噬細胞標(biāo)志物(iNOS、IL-1β、IL-6)的表達明顯增加，并且IRF5的表達水平也明顯增加，給予si-IRF5轉(zhuǎn)染后，M1型巨噬細胞標(biāo)記物表達水平降低。提示IRF5在心肌梗死后M1型巨噬細胞極化過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，心肌梗死后心肌組織IRF5表達顯著上調(diào)，伴隨著M1型巨噬細胞極化，加重心肌梗死后炎癥反應(yīng)和心臟重構(gòu)。提示IRF5可以作為調(diào)節(jié)M1型巨噬細胞極化的主要因子，參與心肌梗死后心臟重構(gòu)，為深入探討心肌梗死后的心臟重構(gòu)的分子機制及治療提供新的思路。