王媛 尤宏釗 任璐 馬友才 王綠婭 王雪 杜杰

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心血管病中危重的急性事件，近年來發(fā)病率有上升趨勢(shì)[1］。大量研究證明，急性心肌梗死會(huì)導(dǎo)致心室結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)改變，包括心肌細(xì)胞凋亡、膠原沉積、肥大等，這些改變的機(jī)制尚未明確[2］。動(dòng)物模型在研究急性心肌梗死中起到橋梁作用。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠心肌梗死建模后14d所在分期對(duì)應(yīng)急性心肌梗死后重構(gòu)期，并且認(rèn)為重構(gòu)期在急性心肌梗死后的心臟修復(fù)中起到重要作用[3］。但是，既往研究較多關(guān)注在急性心肌梗死早期病理變化情況，而對(duì)心肌梗死損傷重構(gòu)期分子表達(dá)水平，特別是是重構(gòu)期心臟組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究甚少[4］。準(zhǔn)確描述急性心肌梗死后重構(gòu)期蛋白譜的變化，不僅對(duì)探究病理生理學(xué)過程尤為重要，還可為篩選潛在的藥物治療靶點(diǎn)提供分子學(xué)信息。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究某類組織中所有蛋白質(zhì)組成和功能的科學(xué)。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)通常用雙向凝膠電泳圖譜分析(2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2DPAGE)技術(shù)進(jìn)行研究[5］，這種方法鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量有限且不能精確定量，介于上述缺陷，我們采用新近報(bào)道的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)[6］，本技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于吞吐量高，穩(wěn)定性高，不受樣本屬性限制[7］。研究應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對(duì)急性心肌梗死重構(gòu)期心臟組織蛋白進(jìn)行定量分析，在結(jié)合生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上，分析差異蛋白所涉及的生物學(xué)進(jìn)程，并探討涉及的信號(hào)通路。

材料與方法

1.動(dòng)物選擇及分組 健康雄性，C57小鼠，18只，體質(zhì)量18～20g，由北京安貞醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有小鼠術(shù)前禁食6h。本實(shí)驗(yàn)利用隨機(jī)數(shù)字表法將18只小鼠分為兩組(n=9)：分別為對(duì)照組(Sham組)，心肌梗死組(MI 14d組)。

2.材料及試劑 Q-Exactive質(zhì)譜儀購自Thermo Finnigan(美國)。安捷倫常規(guī)液相，戴安納升液相，布魯克Ultraflex，蛋白濃度測定試劑盒購自 ThermoFisher(美國)。胰蛋白酶、SiTRAQ-plex標(biāo)記試劑盒及緩沖液購自Applied Biosystems(美國)。

3.方法 (1)心肌梗死動(dòng)物模型制備過程如本研究室前文所述[8］。將各組小鼠放入氣體麻醉機(jī)chamber中麻醉后固定在鼠板上，迅速打開左前胸暴露心臟，用6-0proline絲線結(jié)扎冠脈，進(jìn)針深度約1mm，觀察左心室前壁顏色由鮮紅變暗紫至蒼白色，快速將心臟推入胸腔。擠出胸內(nèi)氣體，迅速縫合關(guān)胸。SHAM組穿線不結(jié)扎動(dòng)脈，余步驟同MI組。兩組術(shù)后均給予正常飼料飲水，兩組小鼠術(shù)后14d后處死并檢測蛋白表達(dá)水平。(2)小鼠心臟組織制備：各組取3只小鼠，MI組取小鼠左心室結(jié)扎線以下組織，Sham組正常摘取心臟，用液氮迅速冰凍并放入-80℃冰箱保存。(3)酶解及肽段定量標(biāo)記：各取200μg樣品分別加入DTT至終濃度為100mM，沸水浴5min，冷卻至室溫，加200μL UA buffer(8M Urea，150mM TrisHCl pH8.0)混勻，轉(zhuǎn)入 10kd超濾離心管，之后進(jìn)行梯度離心。各組樣品肽段分別去約100μg，按照 AB公司試劑盒：iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進(jìn)行標(biāo)記。

4.質(zhì)譜分析 質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)用軟件Proteome Discoverer 1.3進(jìn)行查庫鑒定及定量分析，采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用(Proteome Discoverer 1.3，Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)庫為Swissprot_mus庫，采用mascot進(jìn)行檢索，檢索的肽段和譜圖匹配(PSM)，q值＜1%(1%的FDR)。檢索后的肽段利用嚴(yán)格的最大簡約原則合并成蛋白。

5.生物信息學(xué)分析分析 結(jié)果如本研究室前文所述[9］。為了降低物種間蛋白質(zhì)異質(zhì)性，所有差異蛋白首先利用Uniprot比對(duì)了人和小鼠中表達(dá)量的差異(www.uniprot.org)，使用AgriGO進(jìn)行g(shù)ene ontology(GO)注釋和富集分析。GO項(xiàng)目描述了蛋白質(zhì)在三個(gè)領(lǐng)域中的作用：生物過程，細(xì)胞成分和分子功能。在注釋和注解增加之后，在“Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”(KEGG，http：//www.genome.p/kegg/)中依次將酶映射到注釋序列和代謝途徑[10］。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)或采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.蛋白質(zhì)的鑒定和定量結(jié)果 基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，本研究解釋了心肌梗死過程中心肌重構(gòu)期差異表達(dá)的蛋白。利用質(zhì)譜技術(shù)，共鑒定了10 324種獨(dú)特的肽，對(duì)應(yīng)1 551種蛋白質(zhì)。

2.重構(gòu)期心肌梗死蛋白表達(dá)譜 為了篩選與正常對(duì)照組有差異的蛋白，我們定義兩組之間差異倍數(shù)＞1.2，或0.8，P＜0.05為差異蛋白，并且同時(shí)應(yīng)滿足所選肽鏈＞1、置信區(qū)間＞95%[11］。在鑒定到的蛋白中，MI組/SHAM組共有383個(gè)蛋白上調(diào)，有309個(gè)蛋白下調(diào)。進(jìn)一步取差異蛋白的交集，我們繪制了上下調(diào)蛋白中前20的顯著差異表達(dá)譜(圖1)。

圖1 前20上下調(diào)蛋白顯著差異表達(dá)譜

3.差異蛋白的生物信息學(xué)分析和信號(hào)通路 為研究差異蛋白的總體趨勢(shì)和功能學(xué)分類，我們用Gene Ontology(GO)對(duì)不同組別的差異表達(dá)蛋白共計(jì)692個(gè)進(jìn)行了富集分析。差異蛋白的GO分析由生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)三個(gè)部分組成。主要結(jié)果分別呈現(xiàn)在圖2～3中。

在生物過程中，MI組與Sham組相比，差異表達(dá)蛋白中上調(diào)蛋白主要涉及到通路集中在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、免疫調(diào)控和炎癥反應(yīng)上(圖2 A)，差異表達(dá)蛋白中下調(diào)蛋白主要涉及葡萄糖代謝、己糖分解代謝及氧化還原反應(yīng)(圖3A)。在細(xì)胞成分上，上調(diào)差異蛋白主要集中在細(xì)胞外區(qū)域及細(xì)胞內(nèi)無膜結(jié)構(gòu)，下調(diào)差異蛋白主要集中在線粒體和肌凝蛋白復(fù)合體等細(xì)胞成分(圖2 B、圖3 B)。在分子功能上，兩組之間的差異表達(dá)蛋白主要涉及在肌動(dòng)蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架連接、軸因子結(jié)合和運(yùn)動(dòng)活性上。

4.差異蛋白所涉及的信號(hào)通路研究 為探究所涉及的信號(hào)通路，我們采用KEGG分析鑒定了差異蛋白，心肌梗死后14d的心臟組織的蛋白表達(dá)主要涉及的信號(hào)通路是免疫反應(yīng)和糖代謝通路。

討 論

急性心肌梗死起病急，恢復(fù)慢且病死率高。在減少心肌壞死的基礎(chǔ)上對(duì)心肌梗死后的心臟進(jìn)修復(fù)可有效改善預(yù)后，提高生存質(zhì)量[11］。重構(gòu)期作為心肌梗死后心臟重構(gòu)的關(guān)鍵時(shí)期，了解蛋白變化及機(jī)制對(duì)疾病的干預(yù)治療有重要意義[12］。目前有關(guān)MI研究主要集中在急性期蛋白表達(dá)情況，對(duì)于心肌重構(gòu)期蛋白譜的變化研究相對(duì)較少。為了探究重構(gòu)期所涉及的蛋白變化，我們運(yùn)用iTRAQ技術(shù)首次定量檢測心肌梗死重構(gòu)期差異表達(dá)的蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)和公共數(shù)據(jù)庫，描繪差異蛋白譜，發(fā)現(xiàn)其中主要涉及的病理過程是免疫反應(yīng)和糖類代謝。

圖2 急性心肌梗死重構(gòu)期差異表達(dá)上調(diào)的蛋白生物信息學(xué)分析 A：SHAM/MI 14天組上調(diào)蛋白生物進(jìn)程分析；B：SHAM/MI 14天組上調(diào)蛋白細(xì)胞成分預(yù)測；C：SHAM/MI 14天組上調(diào)蛋白分子功能預(yù)測；D：SHAM/MI 14天組上調(diào)蛋白信號(hào)通路分析

圖3 急性心肌梗死重構(gòu)期差異表達(dá)上調(diào)的蛋白生物信息學(xué)分析 A：SHAM/MI 14天組下調(diào)蛋白生物進(jìn)程分析；B：SHAM/MI 14天組下調(diào)蛋白細(xì)胞成分預(yù)測；C：SHAM/MI 14天組下調(diào)蛋白分子功能預(yù)測；D：SHAM/MI 14天組下調(diào)蛋白信號(hào)通路分析

早期研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌梗死模型中，心肌損傷可激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，富含線粒體的亞細(xì)胞成分釋放觸發(fā)級(jí)聯(lián)早期作用成分C1～C4的釋出[13-14］。補(bǔ)體系統(tǒng)在活化過程中產(chǎn)生具有生物活性的蛋白片段，在中期持續(xù)升高會(huì)影響心肌梗死的恢復(fù)[12］。C4d、Bb分別是補(bǔ)體的經(jīng)典和替代激活途徑的產(chǎn)物。本項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)心肌梗死重構(gòu)期補(bǔ)體C5的水平顯著升高，這與既往研究結(jié)果一致。C5b-9組成攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)，具有溶細(xì)胞作用[15］，在AMI患者血漿中MAC升高導(dǎo)致死亡率和心血管事件發(fā)生率升高[16］。既往動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，利用抗-C5補(bǔ)體Pexelizumab輔助治療可減少急性心肌梗塞后再灌注損傷，并在II期臨床研究中證實(shí)了在急性冠脈綜合征患者中獲益[17］。此外，國內(nèi)外的研究中也表明采用補(bǔ)體抑制劑抑制補(bǔ)體系統(tǒng)，可有效減輕心肌的缺血性損傷，縮小梗死面積。其次，缺血心肌細(xì)胞在調(diào)節(jié)因子的作用下產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[18］。大量實(shí)驗(yàn)表明熱休克蛋白、ATP、線粒體在心肌受損后刺激炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這些危險(xiǎn)信號(hào)通過刺激Toll樣受體家族成員發(fā)揮抗炎作用[19］。細(xì)胞基質(zhì)蛋白凝血酶敏感蛋白(TSP)-1作為縮血管蛋白，在缺血過程中從內(nèi)皮和心肌細(xì)胞中釋放，促進(jìn)血小板在動(dòng)脈粥樣硬化病變的內(nèi)皮下層粘附聚集，在心肌缺血過程中，TSP-1通過激活CD47和CD36破壞NO信號(hào)通路和VEGF信號(hào)通路，干擾局部微循環(huán)，最終導(dǎo)致梗死后的過度纖維化。研究表明，TSP-1在心肌梗死后恢復(fù)有抑制作用[20］。

蛋白和糖代謝正常心臟可以利用多種底物產(chǎn)生能量，如脂肪酸、酮體、葡萄糖等[21］。心肌缺血時(shí)，心肌供氧不足，抑制脂肪酸的有氧氧化，無氧糖酵解增加，此時(shí)葡萄糖成為心肌主要能量來源[22］。有研究發(fā)現(xiàn)：能量代謝障礙發(fā)生后心肌細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)均受到影響，且心肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平與其凋亡壞死密切相關(guān)[23］。在心肌細(xì)胞中，線粒體作為最復(fù)雜的細(xì)胞器之一，承擔(dān)有眾多細(xì)胞功能包括脂肪酸代謝、能量產(chǎn)生和糖代謝等，前人研究證明在MI中心肌細(xì)胞線粒體活性與正常心肌相比下降嚴(yán)重[24］，這也從側(cè)面印證了我們的研究結(jié)果。更為重要的是，既往研究發(fā)現(xiàn)及時(shí)糾正代謝異常可以有效地減少M(fèi)I范圍，我們的研究為進(jìn)一步揭示了糖代謝在心肌梗死重構(gòu)期的作用機(jī)制及尋找潛在的干預(yù)靶點(diǎn)提供了組學(xué)數(shù)據(jù)。

本研究首次利用相對(duì)定量的方法，探究了與正常心臟相比，心肌梗死14d后小鼠心臟組織蛋白表達(dá)的差異，并結(jié)合生物信息學(xué)，對(duì)差異蛋白進(jìn)行了GO分析和通路分析，為探究蛋白表達(dá)水平在急性MI重構(gòu)期的變化以及尋找潛在治療靶點(diǎn)提供了結(jié)果支持。研究仍存在局限，iTRAQ實(shí)驗(yàn)在蛋白定量過程中并不是鑒定到的所有肽段均參與蛋白定量過程，可能在篩選過程中會(huì)出現(xiàn)遺漏情況；雖然在公共數(shù)據(jù)庫中比對(duì)了人和鼠間差異，但仍做不到全部排除不同物種間異質(zhì)性。

綜上所述，定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可用于組織蛋白鑒定和相對(duì)定量，利于更全面的了解蛋白與MI重構(gòu)期的病理變化關(guān)系。本項(xiàng)研究的結(jié)果為探究急性MI重構(gòu)期心臟組織蛋白所涉及的病理過程和潛在的治療靶點(diǎn)提供了新的觀點(diǎn)和證據(jù)。