單曉楓 ， 張冬星 ， 康元環(huán) ， 孫武文 ， 吳同壘 ， 王桂芹 ， 錢愛東

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2. 河北科技師范學院河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室 ， 河北 秦皇島 066004)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是氣單胞菌科氣單胞菌屬的代表株，對人及多種動物均具有一定的致病性，是典型的人、獸、水生動物共患病原菌[1]。其分布廣泛，可作為水生動物正常菌群存在于腸道中，當機體抵抗力下降可自身感染或通過糞便等排出體外而感染其他易感動物，甚至當人類在處理相關食材不得當時也易被其感染而發(fā)病。

烏鱧(Channaargus)是一種經(jīng)濟價值與營養(yǎng)醫(yī)學價值均較高的魚類，其肉質(zhì)鮮美、抗逆性強，可以抵抗多種傳染性疾病[2]，很多病原可以寄生其體內(nèi)而不引起烏鱧死亡，與其他水生動物混養(yǎng)可能會造成其疾病的發(fā)生，人類如果食用消毒不徹底的烏鱧或食材前處理操作不得當，可能會感染人類而對機體造成危害。而具有致病性的嗜水氣單胞菌可能作為烏鱧腸道菌群潛伏在體內(nèi)，一旦該菌接觸到其他水生動物或人類，可能造成感染引發(fā)疾病。因此，本調(diào)查以長春市市售烏鱧為研究材料，對其體內(nèi)攜帶嗜水氣單胞菌情況進行調(diào)查，研究結果為使用烏鱧的公共衛(wèi)生安全，以及預防嗜水氣單胞菌感染人及動物引發(fā)疾病提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種與實驗動物 嗜水氣單胞菌標準株ATCC7966，本實驗室保存。昆明系小鼠，體重約15g/只，購自吉林省實驗動物中心；斑馬魚，購自長春市某花鳥魚市場。

1.2 主要試劑 RS鑒別培養(yǎng)基、AHM培養(yǎng)基，購自北京陸橋生物技術責任有限公司；細菌微量生化反應管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；TaqDNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑，均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 樣品采集 采樣時間，2016年5—10月；采集長春市水產(chǎn)市場表觀健康烏鱧，活體運送至實驗室、麻醉、表面消毒，無菌條件下采取烏鱧腸道，保存。

1.4 細菌的分離鑒定 無菌操作取腸道內(nèi)容物接種于RS培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng) 18 h，隨機挑取5個特征性菌落接種液體LB培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng) 12 h，再次用RS培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，挑取單個菌落純培養(yǎng)。參照陸承平制定的國標隊純化的菌株進行初步鑒定[3]。

將初步鑒定為嗜水氣單胞菌的菌株用熱裂解法提取基因組，以儲衛(wèi)華[4]設計的特異性16S-rRNA基因引物對其進行PCR擴增(見表1)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨機挑取685 bp左右出現(xiàn)條帶者、純化其PCR產(chǎn)物，送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果與GenBank進行比對，已驗證PCR反應正確性。將最終鑒定為嗜水氣單胞菌的菌株進行凍干保存。

1.5 細菌攜帶毒力基因檢測 以上述鑒定為嗜水氣單胞菌分離株基因組DNA為模板，對嗜水氣單胞菌的氣溶素(aer)、絲氨酸蛋白酶(ser)、溶血素(hly)、黏附素(Aha)、細胞毒性腸毒素(act)以及群體感應系統(tǒng)調(diào)控基因(LuxS)等6個毒力基因片段進行擴增(見表1)[4-7]。

1.6 代表菌株致病性試驗 選取攜帶不同毒力基因的嗜水氣單胞菌分離株，分別以斑馬魚、昆明系小鼠為實驗動物進行致病性試驗，觀察一周，記錄死亡情況；同時設陰性對照組。統(tǒng)計結果以Reed與Muench的方法計算LD50。

2 結果

2.1 細菌分離株理化鑒定結果 經(jīng)RS鑒別培養(yǎng)基分離，共獲得菌落為黃色、圓形的分離株301株，純化后，按國家標準GB /T 1865222002進一步鑒定：

表1 PCR反應所用的引物及目的片段大小

選取AHM培養(yǎng)基頂部紫黑色、底部黃色，運動性陽性，氧化酶陽性，吲哚陽性，葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷陽性，革蘭陰性的分離株，初步定為嗜水氣單胞菌。進行分子生物學鑒定。

2.2 細菌分子生物學鑒定 對初步鑒定為嗜水氣單胞菌的分離株，通過嗜水氣單胞菌16S rRNA特異性而進行PCR鑒定，電泳檢測，在685 bp左右出現(xiàn)目的條帶的菌株可判定為嗜水氣單胞菌陽性。隨機選取分離株PCR擴增產(chǎn)物測序，經(jīng)GenBank比對，證實所測分離株為嗜水氣單胞菌。

經(jīng)理化試驗、分子生物學鑒定結果綜合判定，共獲得107株嗜水氣單胞菌，所占分離株比例為35.55%。

2.3 細菌分離株攜帶毒力基因檢測結果 除LuxS基因外，107株嗜水氣單胞菌分離株攜帶5種毒力基因檢測結果如下：5種毒力基因都存在的菌株占14.0%(15/107)、攜帶4種毒力基因的菌株占20.56%(22/107)、攜帶3種毒力基因的菌株占20.56%(22/107)、攜帶2種毒力基因的菌株占17.76%(19/107)、只有1種毒力基因的菌株占11.21%(12/107)、5種毒力基因均沒有的菌株占15.89%(17/107)。

107株嗜水氣單胞菌分離株中攜帶aer基因的菌株有87株(81.31%)、攜帶hly基因的菌株76株(71.03%)、攜帶act基因的菌株32株(29.91%)、攜帶Aha基因的菌株37株(34.58%)、攜帶ser基因的菌株82株(76.64%)。作為群體感應系統(tǒng)的標志基因LusX，有88.79%(95/107)的菌株攜帶該基因。

2.4 代表菌株致病性實驗結果 隨機選取攜帶0種、1種、2種、3種、4種、5種毒力基因(LusX基因除外)嗜水氣單胞菌分離株各1株，分別對小鼠及斑馬魚進行LD50的測定，其菌株毒力基因型及對小鼠、斑馬魚LD50結果如表2所示。從表中可以看出，攜帶毒力基因的菌株對小鼠、斑馬魚均有一定的致病性；且隨著菌株攜帶毒力基因數(shù)的增多，致病力也隨之增強；而同一菌株對斑馬魚的致病力要強于小鼠。

表2 嗜水氣單胞菌代表株致病性試驗

3 討論

烏鱧肉質(zhì)鮮美，是我國淡水魚類生魚片的主要食材，但其抗逆性也較強，體內(nèi)往往攜帶多種病原生物而自身不發(fā)??；其中，體內(nèi)存在的嗜水氣單胞菌是典型的人-獸-魚共患病病原菌，其致病菌株可感染混養(yǎng)的其他魚類，也可能感染接觸該菌的人類。

本試驗檢測，長春市水產(chǎn)市場表觀健康的烏鱧體內(nèi)嗜水氣單胞菌分離率為35.55%(107/301)，這與我國其他鮮活水產(chǎn)品嗜水氣單胞菌攜帶率有所差異[8-10]，可能與樣品不同、采樣時間不同有一定關聯(lián)。試驗對嗜水氣單胞菌分離株5種毒力相關基因進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)，超過70%以上的菌株攜帶aer、ser、hly基因，而大量研究證實，氣單胞菌aer、ser基因與菌株的致病性有較大的關聯(lián)；本試驗的致病性結果也顯示，攜帶aer、ser、hly基因的分離率對小鼠及斑馬魚具有一定的致病性。通過以上結果是否可以提出一種假設：烏鱧體內(nèi)攜帶大多數(shù)嗜水氣單胞菌分離株均存在潛在的致病風險？這需要進一步實驗驗證。

本試驗也對LusX基因進行了檢測，結果顯示，有88.79%(95/107)的嗜水氣單胞菌分離株攜帶該基因，LusX基因與細菌的群體感應密切相關，而群體感應系統(tǒng)與細菌致病性、生物被膜的形成以及耐藥性具有一定關聯(lián)[11]，攜帶該基因嗜水氣單胞菌分離株的大量存在，暗示這些細菌在宿主體內(nèi)可能形成生物被膜，一旦這些菌株引發(fā)疾病，其形成的生物被膜可能會給用藥帶來較大困難。

參考文獻：

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