朱兆榮 ， 關(guān) 璐 ， 彭 詩(shī) ， 劉 娟

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 重慶 榮昌 402460 ； 2.重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心中藥創(chuàng)新研究室 ， 重慶 榮昌 402460)

骨關(guān)節(jié)炎是犬的一種退行性骨關(guān)節(jié)疾病，是由于增齡、創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)先天性異常、關(guān)節(jié)畸形等原因引起的關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，是犬的一種比較常見(jiàn)多發(fā)的疾病，患病時(shí)伴有炎癥反應(yīng)和疼痛反應(yīng)。膝關(guān)節(jié)周圍有很多穴位，通過(guò)電針對(duì)它們的刺激能有效促進(jìn)機(jī)體對(duì)內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)的釋放，起到明顯緩解疼痛，消除炎癥的作用，同時(shí)可以促進(jìn)血液循環(huán)，疏通經(jīng)脈，利于關(guān)節(jié)軟骨再生修復(fù)和周圍組織滲透液的吸收。腺苷作為一種重要的抑制炎癥反應(yīng)的內(nèi)源性核苷[1]，其受體還與疼痛信息傳遞和調(diào)控有關(guān)[2]。腺苷常用測(cè)定方法有紙層析分光光度法[3]、紫外分光光度法[4]、高效液相測(cè)定等，其中高效液相色譜法具有高效高速高靈敏度的特點(diǎn)，可以更好的分離血漿中相對(duì)含量較少的腺苷，因此選用高效液相法以及最適條件進(jìn)行含量測(cè)定。本研究采用木瓜蛋白酶制造犬骨關(guān)節(jié)炎模型，采用電針?lè)椒ㄖ委熤寥?，通過(guò)高效液相法測(cè)定腺苷含量變化，為電針治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中華田園犬32只，平均年齡3個(gè)月齡，體重2.5±0.5 kg，由西南大學(xué)榮昌校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。

1.2 試劑及儀器 木瓜蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)；低速離心機(jī)(菲恰爾GL-16A)；Model 680酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories，Inc)；華佗牌電子針療儀(SDZ-Ⅱ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；LC-20AD型泵(日本島津公司)；SPD-20A紫外檢測(cè)器(日本島津公司)；CTO-20A柱溫箱(日本島津公司)；DGU-20A3脫氣機(jī)(日本島津公司)；C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)(日本島津公司)；AE-240S電子分析天平(梅特勒—托利多儀器有限公司)；AB135-S型十萬(wàn)分之一電子分析天平(METTLER TOLEDO公司)；SB-25-12型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)等。

1.3 動(dòng)物模型建立與分組處理 參照文獻(xiàn)[5]，選取32只健康中華田園犬隨機(jī)分對(duì)照組和模型組，模型組于試驗(yàn)開(kāi)始第1、4、7天，在左膝關(guān)節(jié)腔注射0.5 mL體積分?jǐn)?shù)4%木瓜蛋白酶，對(duì)照組同時(shí)注射生理鹽水0.5 mL，將模型建立成功的犬隨機(jī)分為3組，每組8只，即：模型組(不治療)、電針1組(電針[4]左側(cè)環(huán)跳穴、陽(yáng)陵泉穴、后三里穴)、電針2組(電針[6]左側(cè)環(huán)跳穴、掠草穴、腎俞穴)，以30號(hào)針針刺20 min，1次/d，連續(xù)14 d，采血檢測(cè)犬血漿中腺苷含量。

1.4 犬血漿中腺苷的高效液相色譜溶液制備

1.4.1 對(duì)照品溶液制備 取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定10 mg，加純化水制成1 g/L腺苷儲(chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液適量，并用純化水定容于10 mL量瓶中，搖勻，配置成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 供試品溶液制備 取新鮮犬血，靜置使腺苷被細(xì)胞完全滅活。將75 mmol/L-1的雙嘧達(dá)莫氯仿溶液1 mL加入潔凈離心管中，輕輕振搖，使整個(gè)管壁接觸到溶液，然后靜置待液體蒸發(fā)干，備用。將采集靜置后的血樣置于上述雙嘧達(dá)莫離心管中，立即以3 500 r/min離心5 min分離出血漿。

1.5 犬血漿中腺苷的高效液相色譜測(cè)定方法學(xué)考察

1.5.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液[50 mmol/L-1磷酸二氫鈉-50 mmol/L-1磷酸氫二鈉，500∶80]-甲醇(80∶20，pH值5.9)為流動(dòng)相；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣20 μL；流速：1 mL/min。

1.5.2 方法專屬性考察 取新鮮犬血，靜置使腺苷被細(xì)胞完全滅活，3 500 r/min離心5 min，分離得空白血漿。分別取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品、血漿樣品、空白血漿以及空白血漿加腺苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，按“1.4.1”項(xiàng)下操作，將配置好的待測(cè)樣品按上述色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3 線性關(guān)系考察 取腺苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1 g/L，用純化水依次稀釋為40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL。按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果以對(duì)照品濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析。

1.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 樣品采集按照1.4.2項(xiàng)下的要求，在室溫下立即放置2 h后進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理后立即放置20 min和40 min后分別進(jìn)樣測(cè)定含量。

1.5.5 精密性試驗(yàn) 精密量取空白血漿樣品200 μL，加入適量腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成濃度為40 mg/L 血漿樣品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定6次，計(jì)算腺苷峰面積分值RSD。

1.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批血漿樣品6份，按供試品溶液配制方法制備，分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算腺苷含量和RSD值。

1.5.7 加樣回收試驗(yàn) 精密量取空白血漿樣品200 μL，加入適量腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成濃度為40 mg/L血漿樣品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度和回收率，測(cè)定本試驗(yàn)建立的方法的準(zhǔn)確性，通過(guò)平行設(shè)定6個(gè)重復(fù)。

1.6 高效液相色譜測(cè)定犬血漿中腺苷含量

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品制備 同“1.4.1”及“1.4.2”。

1.6.2 樣品測(cè)定 精密量取血漿樣品200 μL，加入100 μL純化水，再加入400 μL乙腈，靜置10 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定，進(jìn)樣量20 μL,檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法 統(tǒng)計(jì)分析用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并進(jìn)行分析比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 高效液相色譜測(cè)定犬血漿中腺苷的方法學(xué)考察結(jié)果 為考察高效液相色譜測(cè)定犬血漿中腺苷的方法是否可行，本試驗(yàn)進(jìn)行了如下專屬性、穩(wěn)定性和精密性考察。

2.1.1 專屬性考察 測(cè)定結(jié)果色譜圖見(jiàn)圖1，在腺苷對(duì)照品峰(圖1A)的保留時(shí)間上供試品(圖1B)有相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)對(duì)應(yīng)色譜峰(圖1C)，表明用此法在測(cè)定犬血漿中腺苷含量時(shí)具有較好的專屬性。

2.1.2 線性關(guān)系考察 用建立的犬血漿中腺苷含量測(cè)定方法測(cè)定在濃度為40 μg/mL～0.5 μg/mL腺苷對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量20 μL，計(jì)算得到線性回歸方程為Y=1×10-5X-0.0183，回歸系數(shù)R=0.9999，表明腺苷在0.50～40.00 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 腺苷色譜

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 計(jì)算得腺苷含量RSD分別為0.2961%和3.9864%，結(jié)果說(shuō)明制備的供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 精密性試驗(yàn) 計(jì)算得腺苷峰面積分值RSD為0.090%。說(shuō)明建立方法的精密度良好。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 計(jì)算腺苷含量和RSD值，平均含量為0.0054%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=6.294%。結(jié)果說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.3 加樣回收試驗(yàn) 測(cè)得平均回收率(n=6)為99.96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.045%。

2.4 高效液相色譜測(cè)定犬血漿中腺苷含量結(jié)果 結(jié)果表明，模型組血漿中腺苷含量明顯下降，和對(duì)照組比較，差異極顯著(P<0.01)；電針1組、電針2組血漿中腺苷含量明顯升高，與模型組比較，差異極顯著(P<0.01)，電針1組與電針2組之間比較差異極顯著(P<0.01)；結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 電針治療后各組犬血漿中腺苷水平

注：同列肩標(biāo)不同字母表示差異極顯著(P<0.01)

3 分析討論

中醫(yī)認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎屬于“痹癥”，多由風(fēng)、寒、濕、熱、痰、瘀引起，兼肝、腎虛致正氣不足、筋骨不固，風(fēng)寒濕邪阻滯經(jīng)絡(luò)，導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，經(jīng)絡(luò)阻滯，久之骨失所養(yǎng)而發(fā)病。治療以溫經(jīng)通絡(luò)、活血逐痹為主。本試驗(yàn)中，選取環(huán)跳、掠草為主穴，分別選取陽(yáng)陵泉、后三里和腎腧、后跟為配穴。通過(guò)針刺肢體穴位，以達(dá)到益氣活血、通絡(luò)止痛的作用。環(huán)跳穴為足少陽(yáng)膽經(jīng)與足太陽(yáng)膀胱經(jīng)交會(huì)穴,膀胱與腎相表里,故其具有益腎氣固胞宮之功,肝與膽相表里,肝喜條達(dá),膽欲疏通,太陽(yáng)主表,少陽(yáng)主樞,故其具有疏通經(jīng)絡(luò),宣表散寒,調(diào)理氣血,祛風(fēng)勝濕,通陽(yáng)助陽(yáng)之效[6]。有研究表明[7]，環(huán)跳穴在改善膝骨關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀體征積分方面優(yōu)于常規(guī)針刺。掠草主治膝關(guān)節(jié)扭傷、神經(jīng)痛等；陽(yáng)陵泉主治后肢麻痹、膝關(guān)節(jié)扭傷；后三里主治后肢疼痛，有學(xué)者研究[8]表明，后三里具有確切的鎮(zhèn)痛作用；腎俞主治扭傷，后跟主治扭傷、后肢麻痹。前期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)中選用的電針療法[10]，改善了膝關(guān)節(jié)血液循環(huán)，有利于吸收多余關(guān)節(jié)滲出液以及促進(jìn)修復(fù)骨關(guān)節(jié)滑膜，使犬的膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)正常，疼痛腫脹消失，運(yùn)動(dòng)恢復(fù)正常。

膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶溶液可導(dǎo)致白細(xì)胞數(shù)量增多[9]，因此犬骨關(guān)節(jié)炎會(huì)伴隨炎癥反應(yīng)。炎癥，是機(jī)體抵御外來(lái)刺激的一種防御性免疫機(jī)制，過(guò)度的炎癥反應(yīng)則會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，嗜中性粒細(xì)胞是其中重要的參與者之一，有研究表明[10]，腺苷及其受體可以通過(guò)參與其粘附、遷移、細(xì)菌殺傷作用、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、凋亡等過(guò)程的調(diào)節(jié)，從而對(duì)炎癥起到調(diào)節(jié)作用。腺苷存在于外周血液及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是一種具有多種調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)活性物質(zhì)，主要通過(guò)與細(xì)胞表面的特殊受體結(jié)合后發(fā)揮作用。犬患骨關(guān)節(jié)炎后，局部炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，腺苷含量明顯降低，導(dǎo)致機(jī)體調(diào)節(jié)炎癥的能力下降，電針刺激后，腺苷含量有所上升，可能是高濃度的腺苷降低了嗜中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮的粘附作用[11]，從而減輕了炎癥。

當(dāng)炎癥反應(yīng)加強(qiáng)時(shí)，會(huì)引起痛覺(jué)敏感性升高，機(jī)體產(chǎn)生疼痛反應(yīng)。研究表明，內(nèi)源性核苷及其類似物在疼痛調(diào)節(jié)方面有一定作用[12]。腺苷受體中的A1受體主要分布在脊髓中，內(nèi)源性腺苷通過(guò)激活A(yù)1受體抑制病理性痛。本試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M犬血清腺

苷含量明顯降低，在電針刺激后局部血液組織中的腺苷含量明顯升高，說(shuō)明其可能與脊髓中A1受體相結(jié)合，從而減輕疼痛反應(yīng)。推測(cè)犬血清腺苷含量升高和降低與犬疼痛癥狀出現(xiàn)和減輕相關(guān)。

綜上所述，電針環(huán)跳等穴可升高骨關(guān)節(jié)炎犬血清腺苷水平，降低炎癥反應(yīng)，減緩疼痛，同時(shí)電針掠草等穴也能產(chǎn)生同樣治療效果，這可能與電針改善局部血液循環(huán)、緩解炎癥狀態(tài)及局部張力、提高痛閾有關(guān)，推測(cè)電針刺激可通過(guò)調(diào)節(jié)腺苷分泌的增多和減少，使膝關(guān)節(jié)的功能得以恢復(fù)。

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