楊強，徐盼，蔣凱，喬傳民，任軍，黃路生，幸宇云

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慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)編輯PFF細(xì)胞BMPR-IB基因及BMPs信號通路重要基因表達(dá)分析

楊強，徐盼，蔣凱，喬傳民，任軍，黃路生，幸宇云

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)省部共建國家重點實驗室，南昌 330045）

【】利用慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)獲得編輯BMPR-IB（bone morphogenetic protein receptor, type IB）基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞（pig fetal fibroblasts, PFF），并研究該基因被編輯后對骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）信號通路中重要功能基因表達(dá)的影響?！尽酷槍ωi的BMPR-IB基因的外顯子8，利用在線軟件http://crispr.mit.edu獲得了21條sgRNAs（single-guide RNAs）序列；得分最高的sgRNA與互補序列（包含接頭）退火成雙鏈后連接入線性化的lentiCRISPR v2質(zhì)粒以獲得打靶質(zhì)粒，打靶質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒psPAX2和pCMV-VSV-G按5﹕4﹕1質(zhì)量比混合后通過293T細(xì)胞包裝慢病毒。慢病毒溶液經(jīng)0.45 μm濾膜回收后與PFF細(xì)胞培養(yǎng)液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺（polybrene）至終濃度為6 μg·mL-1，在1 000 g轉(zhuǎn)速、32℃下離心感染PFF細(xì)胞1 h。感染3 d后，細(xì)胞在含3.5 μg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)液中篩選6—7 d，最終獲得編輯BMPR-IB基因的PFF細(xì)胞克隆群。針對編輯（打靶）細(xì)胞，首先通過T7E1酶切檢測突變體，初步判斷打靶效率，再通過PCR、PCR-TA克隆分析細(xì)胞的編輯及脫靶情況。利用RT-PCR檢測編輯和對照組細(xì)胞中與BMPs信號通路相關(guān)的重要基因的表達(dá)情況；western blotting檢測編輯細(xì)胞與對照組細(xì)胞中BMPR-IB基因的蛋白表達(dá)量。利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒檢測編輯細(xì)胞及對照組細(xì)胞的增殖能力。【】T7E1酶切及PCR測序均證實PFF細(xì)胞成功打靶目標(biāo)DNA區(qū)域；TA克隆測序表明目標(biāo)區(qū)域發(fā)生了插入與缺失突變，突變率為70%。針對20個潛在的脫靶位點的TA克隆測序結(jié)果表明，僅1個位點出現(xiàn)了10%（2/20）的脫靶情況。RT-PCR結(jié)果顯示，打靶細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比，BMPR-IB、CylinD2、Cdk2和Bcl2基因的表達(dá)量均極顯著下降（<0.01）。Western blotting結(jié)果顯示，打靶細(xì)胞BMPR-IB基因的表達(dá)量較對照組細(xì)胞降低62%。CCK-8檢測試驗表明，同一代細(xì)胞中，打靶PFF的增殖能力極顯著低于對照組細(xì)胞（< 0.01）；打靶細(xì)胞中，隨著傳代的（P5、P7和P9）增加其增殖能力極顯著下降（< 0.01），而對照組細(xì)胞不同代次間細(xì)胞增殖能力無顯著差異（> 0.05）；打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素篩選的影響?！尽柯《窘閷?dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)可針對PFF細(xì)胞快速高效地實現(xiàn)基因編輯；在BMPR-IB基因編輯細(xì)胞中，BMPs通路重要功能基因的表達(dá)量顯著下降，該基因?qū)FF細(xì)胞的增殖有重要的調(diào)節(jié)作用。

慢病毒；CRISPR/Cas9；豬胎兒成纖維細(xì)胞；；脫靶；細(xì)胞增殖

0 引言

【研究意義】基因組編輯技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域的一項重要革新性技術(shù)，在功能基因組學(xué)研究、經(jīng)濟(jì)物種的遺傳改良、生物醫(yī)藥、基因治療等領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。自2013年CRISPR/Cas9技術(shù)成功地在人和小鼠細(xì)胞中實現(xiàn)基因組編輯[1-3]以來，該技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用呈現(xiàn)出井噴的態(tài)勢，目前已被廣泛應(yīng)用于動物、植物、微生物和人類醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。豬胎兒成纖維細(xì)胞（porcine fetal fibroblasts, PFF）是研制轉(zhuǎn)基因克隆豬的重要供體細(xì)胞，然而常規(guī)化學(xué)轉(zhuǎn)染法對PFF細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低[4-5]。慢病毒對分裂和非分裂細(xì)胞均有感染能力，且能夠有效地感染較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞[6]，因此慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)用于PFF細(xì)胞基因組編輯，可以更好地克服其難轉(zhuǎn)染的問題。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）是轉(zhuǎn)化生長因子β亞基（transforming growth factor-β, TGF-β）的一個亞家族，此家族所編碼的多功能蛋白在各種組織中具有廣泛的生物活性，在多種細(xì)胞中起調(diào)節(jié)生長和分化的作用。BMPR-IB基因?qū)儆贐MP家族I型受體，在將BMPs通路信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核過程中起著至關(guān)重要的作用[7]。【前人研究進(jìn)展】目前鮮見慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)用于PFF細(xì)胞的報道。LIU等[8]和LAI等[9]利用慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)分別將Cas9基因和Oct4-tdTomato報告基因敲入PFF細(xì)胞中，該兩項研究均使用了超速離心機濃縮病毒。研究表明，BMPR-IB基因在成骨細(xì)胞[10-12]和卵泡顆粒細(xì)胞[13]的分化和凋亡過程中均起重要作用。此外，羊的746突變位點被證明是影響部分綿羊品種多羔性狀的主效突變位點[14-16]。ZHAO等[13]通過siRNA干擾的方式將豬卵泡顆粒細(xì)胞中的BMPR-IB基因沉默后，會顯著抑制顆粒細(xì)胞的增殖和促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡，并且會影響CylinD2、Cdk2、Bcl2、Cyp19a1等基因的表達(dá)[13]?！颈狙芯壳腥朦c】目前利用慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)針對PFF細(xì)胞開展基因組編輯的研究報道較少，且已有的研究往往利用昂貴的超速離心機對慢病毒進(jìn)行了濃縮[8-9]；此外，之前暫無BMPR-IB基因?qū)FF細(xì)胞增殖或凋亡的影響的相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬針對PFF細(xì)胞建立快速和高效的、慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系；并分析BMPR-IB基因編輯后對PFF細(xì)胞BMP信號通路中重要功能基因表達(dá)及細(xì)胞增殖能力影響。

1 材料與方法

本研究于2016—2017年在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)省部共建國家重點試驗室完成。

1.1 試驗材料

1.1.1 細(xì)胞系和質(zhì)粒 豬胎兒成纖維細(xì)胞系由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)省部共建國家重點實驗室前期所建立；293T細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫（http://www.cellbank.org.cn/）；PX458（Addgene: #48138）、lentiCRISPR v2（Addgene: #52961）、psPAX2（Addgene: #12260）、pCMV-VSV-G（Addgene: #8454）均購自Addgene質(zhì)粒庫（http://www.addgene.org/）；Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)公司。

1.1.2 試驗試劑 聚凝胺（polybrene）、嘌呤霉素為Sigma公司產(chǎn)品；胰酶（Trypsin-EDTA solution）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、高糖DMEM（11995-065）、胎牛血清（FBS）為Gibco公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒（QIA prep spin Mini prep kit）、膠回收試劑盒（QIAquick Gel Extraction Kit（50））為QIAGEN公司產(chǎn)品；Lipofectamine 3000 Transfection Reagent為Invitrogen 公司產(chǎn)品；T7核酸內(nèi)切酶Ι（T7E1）、T4連接酶和限制性內(nèi)切酶Ι購自NEB公司；瓊脂糖為Biowest公司產(chǎn)品；細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A. Tissue DNA Kit）為Omega公司產(chǎn)品；r-Taq酶為Takara公司產(chǎn)品；TRIzol試劑（Invitrogen）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；SYBR Premix ExTaq? RT-PCR試劑盒（（TaKaRa）；RIPA裂解液（強）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自碧云天公司；兔源BMPR-IB一抗（ab97051）、鼠源β-actin一抗（mAbcam 8226）、BMPR-IB二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，ab97051）、β-actin二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，ab6789）均購自abcam公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.1.3 引物合成 sgRNA鏈和檢測引物從Invitrogen公司訂購。

1.1.4 測序 普通測序及TA-克隆測序由華大基因武漢分公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 sgRNA 的設(shè)計和引物合成 針對豬BMPR-IB基因的第8個外顯子，利用麻省理工學(xué)院張鋒（Feng Zhang）實驗室的在線網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu）設(shè)計sgRNA。該軟件針對所設(shè)計的sgRNA序列的潛在脫靶效應(yīng)給予評分，分值越高（滿分為100分）說明潛在脫靶效應(yīng)越低。挑選評分最高的sgRNA序列：5′-GATTGGAAAAGGTCGCTATG-3′，在sgRNA鏈的5′端添加CACCG，在sgRNA互補鏈的5′端添加AAAC、3′端添加堿基C，以使雙鏈sgRNA序列與線性化的lentiCRISPR v2質(zhì)粒連接。表1中的P 1引物對用于檢測sgRNA序列是否與lentiCRISPR v2質(zhì)粒正確連接；P 2和P 3引物用于檢測是否成功打靶；其他引物均用于RT-PCR分析。

表1 載體構(gòu)建、打靶驗證和RT-PCR引物

1.2.2 CRISPR-sgRNA/Cas9打靶DNA的制備 利用20單位B I酶切1 μg lentiCRISPR v2質(zhì)粒DNA，電泳后通過QIAquick Gel Extraction Kit（50）試劑盒割膠回收片段為10 kb的條帶。將sgRNA正向鏈和反向鏈按1﹕1比例于0.5 mL EP管中混勻后，將EP管置于裝有沸水的燒杯，沸水于室溫下冷卻過夜，使單鏈退火形成雙鏈。將50 ng線性化的lentiCRISPR v2質(zhì)粒DNA與1 μL（50 nmol）sgRNA雙鏈通過T 4連接酶相連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐抗性平板篩選、菌落PCR（引物對為P 1）及測序，最后利用QIA Prep Spin Mini Prep Kit提取打靶質(zhì)粒DNA。菌落PCR反應(yīng)體系為：25 μL 體系中含1× buffer，0.5 mmol·L-1Mg2+，0.2 mmol·L-1dNTP（Takara），1 × Q-solution（QIAGEN），0.4 μmol·L-1上游和下游引物，2.5 U r-Taq酶（Takara），1 μL菌液模板。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；（94℃30 s，65℃（-0.5℃/循環(huán)）30 s，72℃1 min）26個循環(huán)；（94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min）14個循環(huán)；72℃10 min。

1.2.3 慢病毒包裝 慢病毒包裝前一天，在兩個10 cm培養(yǎng)皿中分別接種約2.0×106293T細(xì)胞，于37℃、5% CO2箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM。第二天待細(xì)胞密度達(dá)到80%—90%時，通過Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染慢病毒包裝體系于一個10 cm培養(yǎng)皿中，該體系含有5 μg lentiCRISPR v2-sgRNA、4 μg psPAX2和1 μg pCMV-VSV-G。為評估轉(zhuǎn)染效率，將攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的PX458質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染于另一個10 cm培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染后48 h和72 h分別回收病毒上清液，上清液經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后、分裝后置于-80℃冰箱中備用。

1.2.4 慢病毒感染PFF細(xì)胞 在慢病毒感染前一天，將3個不同血緣的第三（P3）代PFF細(xì)胞接種至6孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM。當(dāng)細(xì)胞匯合度約50%時，將6孔板中的培養(yǎng)液替換為病毒上清液與新鮮培養(yǎng)液的1﹕1混勻液，加入polybrene至終濃度為6 μg·mL-1。6孔板于1 000 rcf （relative centrifugal force）轉(zhuǎn)速、32℃下離心1 h后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后更換成正常的培養(yǎng)液。在另一個6孔板中設(shè)置對應(yīng)的3個不同血緣的P3代細(xì)胞作為對照組（野生型），對照組不加病毒上清、不離心，其他條件與試驗組相同。

1.2.5 篩選打靶細(xì)胞 lentiCRISPR v2質(zhì)粒含有嘌呤霉素抗性基因，慢病毒感染前，用P3代PFF細(xì)胞開展嘌呤霉素的抗性試驗。設(shè)置1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 μg·mL-1的嘌呤霉素濃度梯度，記錄細(xì)胞在不同濃度下抗藥時間，選擇4 d能殺死所有細(xì)胞的濃度（3.5 μg·mL-1）為后續(xù)細(xì)胞篩選的濃度。慢病毒感染72 h后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入嘌呤霉素至3.5 μg·mL-1，加入嘌呤霉素后的前兩天，細(xì)胞每天換液一次，之后隔天換液一次。待對照組細(xì)胞全部死亡之后，試驗組細(xì)胞在含2.0 μg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)4 d。

1.2.6 細(xì)胞基因組DNA的提取 胰酶消化并收集打靶細(xì)胞（抗嘌呤霉素）和對照組細(xì)胞，用E.Z.N.A. Tissue DNA Kit提取DNA。

1.2.7 打靶效率的檢測 為檢測是否成功打靶目標(biāo)基因，首先通過P 2引物對（表1）擴增細(xì)胞DNA，PCR反應(yīng)體系及擴增循環(huán)與菌落PCR相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增特異性后，再通過T7E1酶檢測是否產(chǎn)生突變體。然后利用P 3引物對（表1）擴增打靶和對照組細(xì)胞DNA并送測序，PCR反應(yīng)體系及擴增循環(huán)與菌落PCR相同。為分析打靶效率，將打靶細(xì)胞的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆測序，測序結(jié)果與對照組序列通過SeqMan軟件比對分析。

1.2.8 脫靶效應(yīng)檢測 在線軟件http://crispr.mit.edu/在設(shè)計出sgRNA序列的同時，還針對該sgRNA序列在整個基因組的同源性提供潛在的脫靶位點（off-target sites, OTS），并按脫靶可能性的高低給予評分。本試驗針對20個可能性最高的潛在脫靶位點設(shè)計引物（表2），PCR擴增后送TA克隆測序，PCR反應(yīng)體系和擴增循環(huán)與菌落PCR相同，對照組細(xì)胞的PCR產(chǎn)物送普通測序，測序結(jié)果通過SeqMan軟件比對分析。

1.2.9 RT-PCR檢測 以為內(nèi)參基因，針對打靶和對照組細(xì)胞中BMPR-IB、CylinD2、Cdk2、Bcl2、Cyp19a1基因進(jìn)行RT-PCR檢測。RT-PCR采用10.0 μL反應(yīng)體系，體系包括：1× SYBR Premix ExTaq，1× ROX Reference Dye，0.2 μmol·L-1上游和下游引物，cDNA模板1.0 μL；反應(yīng)條件為：50℃2 min；95℃5 min；（95℃15 s，60℃50 s）40個循環(huán)；95℃15 s；60℃15 s；95℃15 s。mRNA相對表達(dá)量計算采用LIVAK等的2ˉΔΔCt法[17]。RT-PCR反應(yīng)在7900HT Fast Real-Time PCR System（ABI公司）上完成，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行檢驗，以＜0.05表示差異顯著，以＜0.01表示差異極顯著。

表2 20個潛在脫靶位點及其檢測引物

OTS按脫靶可能性從高到低排列。參考序列為豬的10.2版本基因組序列

OTS are listed from high to low off-target possibility. Reference sequence: Sscrofa10.2. genome sequence

1.2.10 Western blotting檢測BMPR-IB蛋白表達(dá)量 使用RIPA裂解液（強）分別提取打靶和對照組PFF細(xì)胞的總蛋白。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測2種細(xì)胞的蛋白濃度，各取40 μg蛋白上樣（每種細(xì)胞設(shè)置一個重復(fù)樣），進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，以30 mA 的恒定電流冰浴濕轉(zhuǎn)3 h ，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。于含5%脫脂奶粉的TBST、4℃封閉過夜，然后用TBST洗膜3次，再分別加入1﹕800 稀釋的兔源一抗和1﹕1 000 稀釋的鼠源一抗，室溫下孵育3 h；用TBST洗膜3次，之后分別加入1﹕10 000稀釋的目標(biāo)基因及內(nèi)參基因二抗，在室溫條件下孵育2 h后用TBST洗膜3次。最后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，采取Quantity-One軟件分析條帶光密度值。

1.2.11 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 本試驗經(jīng)打靶藥篩的細(xì)胞為P4代，取1.2.4所述的對照組（3個樣本）和試驗組（3個樣本）的P4代細(xì)胞，在6孔板中分別傳代至P6和P8代，待CCK-8檢測的細(xì)胞經(jīng)計數(shù)后接種到24孔板中培養(yǎng)（即為P5、P7和P9代），每孔的細(xì)胞數(shù)量約為7.5×104個。本試驗設(shè)置3個組：野生型細(xì)胞，打靶細(xì)胞，加嘌呤霉素的打靶細(xì)胞；不含細(xì)胞的培養(yǎng)液為空白對照。依據(jù)CCK-8試劑盒說明書完成相應(yīng)的細(xì)胞處理，每個樣本設(shè)置1個重復(fù)。最后用全自動酶標(biāo)儀（TECAN，infinite M200 PRO）測定吸光度。通過SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，以＜0.05表示差異顯著，以＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 打靶載體的構(gòu)建及慢病毒包裝

本試驗針對豬BMPR-IB基因相對較長的外顯子8（196 bp），并通過http://crispr.mit.edu/軟件共設(shè)計出21條sgRNA序列，得分最高的sgRNA成功連接在lentiCRISPR v2載體上。

利用Lipofectamine 3000試劑將病毒包裝體系轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，最終過濾回收到靶向BMPR-IB基因的慢病毒溶液；對照PX458質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上（圖片未展示）。

2.2 打靶細(xì)胞篩選及打靶效率分析

本試驗在1.5—4.0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，按0.5 μg·mL-1的間隔設(shè)置了6個濃度梯度開展篩選試驗，最終選擇3.5 μg·mL-1的嘌呤霉素濃度篩選打靶細(xì)胞。篩選至第4天，對照組細(xì)胞全部死亡（圖1-d），試驗組（T25，P4代）中發(fā)現(xiàn)10余個細(xì)胞群，每個細(xì)胞群中含有數(shù)量不等的抗嘌呤霉素細(xì)胞，較大細(xì)胞群中的細(xì)胞數(shù)多于100個（圖1-b）。

a：試驗組未經(jīng)藥篩的細(xì)胞；b：試驗組經(jīng)藥篩4 d的細(xì)胞群；c：對照組未經(jīng)藥篩的細(xì)胞；d：對照組細(xì)胞經(jīng)藥篩4 d后（全部死亡）

抽提細(xì)胞DNA，PCR擴增跨sgRNA序列的區(qū)域，利用T7E1酶切PCR產(chǎn)物，打靶細(xì)胞中出現(xiàn)了312 bp和131 bp的產(chǎn)物，而對照組中僅有443 bp的條帶（圖2）。這初步說明CRISPR -sgRNA/Cas9質(zhì)粒成功打靶目標(biāo)基因。

為進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞打靶成功，本試驗通過PCR測序獲得了打靶細(xì)胞sgRNA區(qū)域的測序結(jié)果（圖3）。從圖中可見，試驗組PAM（GGG）前3—4個堿基處出現(xiàn)明顯的重疊峰，而對照組中未出現(xiàn)重疊峰。這說明打靶基因PAM附近出現(xiàn)了堿基缺失或（和）插入突變、導(dǎo)致重疊峰的出現(xiàn)，從而確證了成功編輯目標(biāo)基因。

1：試驗組；2：對照組；3：水；M：marker

a：試驗組；b：對照組。長直線標(biāo)注為sgRNA序列，短直線標(biāo)注為PAM序列

本試驗通過TA-克隆測序獲得了隨機20個克隆的sgRNA區(qū)域的靶向位點序列，分析了其打靶效率（圖4）。結(jié)果表明，20個克隆中出現(xiàn)了1個15 bp和3 bp的缺失突變，1個克隆為CT插入突變，11個克隆為1個T堿基的插入突變，而6個克隆與野生型細(xì)胞的序列一致（圖4）。整體打靶效率為70%。

針對sgRNA設(shè)計軟件所預(yù)測的脫靶效應(yīng)最高的20個潛在脫靶位點，本試驗通過PCR-TA克隆測序分別獲得了每個位點的20個克隆的序列。通過與對照組序列的比對，發(fā)現(xiàn)僅在OTS-2中出現(xiàn)了兩種突變，分別為1 bp和2 bp的插入突變（圖5）。針對OTS-2的脫靶率為10%（2/20），而針對20個OTS的脫靶率為0.5%（2/400）。

#1至#20為sgRNA區(qū)域20個單克隆測序結(jié)果。斜體序列為sgRNA序列，單下劃線標(biāo)注的為PAM序列，虛線表示堿基缺失，雙下劃線表示為插入突變。WT，野生型細(xì)胞

#1-#20：OTS-2的20個單克隆測序結(jié)果。斜體表示為sgRNA序列，單下劃線表示為PAM序列，雙下劃線表示為插入突變。WT，野生型細(xì)胞

2.3 RT-PCR和western blotting結(jié)果

針對BMPR-IB、CylinD2、Cdk2、Bcl2、Cyp19a1基因，分別在試驗組和對照組細(xì)胞中開展了RT-PCR試驗。結(jié)果顯示，打靶細(xì)胞的BMPR-IB、CylinD2、Cdk2、Bcl2基因表達(dá)量極顯著下調(diào)（＜0.01，圖6），但Cyp19a1基因的表達(dá)量無顯著性差異（＞0.05，圖6）。

Western blotting結(jié)果表明，正常未編輯細(xì)胞的BMPR-IB蛋白表達(dá)量是打靶細(xì)胞的2.6倍（圖7），打靶細(xì)胞BMPR-IB蛋白量降低62%。

豬的GAPDH基因作為內(nèi)參基因，每個反應(yīng)3個重復(fù)。** 差異極顯著（P＜0.01）

2.4 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果

CCK-8試驗檢測結(jié)果表明，在同一代細(xì)胞中，野生型細(xì)胞的增殖能力極顯著高于打靶細(xì)胞（＜0.01），而添加嘌呤霉素與不加嘌呤霉素實驗組之間細(xì)胞的增殖能力無顯著差異（＞0.05）（圖8-A）。野生型細(xì)胞不同代次之間的細(xì)胞增殖能力無顯著性差異（＞0.05），而打靶細(xì)胞增殖水平隨著代數(shù)的增加極顯著下降（＜0.01）（圖8-B）

WT：野生型細(xì)胞，Target：打靶細(xì)胞

。

WT：野生型細(xì)胞；Target+P：加嘌呤霉素的打靶細(xì)胞；Target：打靶細(xì)胞。每個試驗組3個樣本，每個樣本一次重復(fù)。**. 差異極顯著（P＜0.01）

3 討論

sgRNA設(shè)計是CRISPR/Cas9編輯技術(shù)的一個重要環(huán)節(jié)，高特異性的sgRNA可有效提高打靶效率和降低脫靶效應(yīng)。目前已有多種軟件可用來設(shè)計sgRNA[18]，這些軟件針對參數(shù)設(shè)置、脫靶位點預(yù)測、sgRNA序列評分等具有不同特點。本試驗利用麻省理工學(xué)院張鋒（Feng Zhang）實驗室建立的CRISPR設(shè)計軟件（http://crispr.mit.edu/），針對BMPR-IB基因的第8個外顯子，共設(shè)計出21條sgRNA序列，得分最低（特異性最差）的為30分，得分最高的為90分，得分80分以上的有5條（具體結(jié)果未顯示）。本試驗選擇得分最高的sgRNA用于打靶載體的構(gòu)建，最終針對PFF細(xì)胞獲得了70%的打靶效率。http://crispr.mit.edu/軟件在設(shè)計sgRNA序列的同時，還針對每一條sgRNA序列預(yù)測潛在脫靶位點，并按脫靶效應(yīng)的高低給予評分，分值越高則脫靶效應(yīng)越強。針對本研究的sgRNA，該軟件共預(yù)測了50個可能的脫靶位點，評分最高的為0.6分（滿分為100分），最低分為0.1分（具體信息未顯示）。本試驗選擇了脫靶效應(yīng)排在前20的開展PCR-TA克隆測序分析，結(jié)果在OTS-2（評分為0.5分）的20個TA克隆中發(fā)現(xiàn)了2個突變體。這說明即使軟件給予的脫靶效應(yīng)評分較低，也不排除脫靶發(fā)生的可能性。眾所周知，存在脫靶效應(yīng)是CRISPR/Cas9技術(shù)目前較明顯的一個缺點。本試驗對20個OTS進(jìn)行驗證，僅發(fā)現(xiàn)一個脫靶位點，但由于未針對所有預(yù)測的OTS進(jìn)行檢測，因此也不排除存在其它脫靶位點的可能性。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，目前已建立起多種捕獲脫靶位點的方法，如CHIP-seq[19-22]、GUIDE-seq[23]、IDLV[24]、digenome-seq[25]等。隨著重測序成本的逐步降低，針對單克隆細(xì)胞的全基因組測序可以較準(zhǔn)確地獲得脫靶位點的信息。

本試驗選擇了攜帶嘌呤霉素的lentiCRISPR v2質(zhì)粒用于編輯PFF細(xì)胞的目標(biāo)基因。相比傳統(tǒng)的新霉素，嘌呤霉素可以更快速地用于哺乳動物細(xì)胞篩選；前者往往需要10—14 d全部殺死沒有抗性的細(xì)胞[26-27]，而后者一般需要3—5 d即可全部殺死不帶抗性基因的細(xì)胞。本試驗選擇了4 d可殺死所有PFF細(xì)胞的濃度（3.5 μg·mL-1）用于篩選打靶細(xì)胞，用8 d即獲得了具有嘌呤霉素穩(wěn)定抗性的細(xì)胞群，合并計算載體構(gòu)建、慢病毒包裝等工作，僅用兩星期左右的時間即獲得了打靶細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染慢病毒包裝體系的過程中，攜帶GFP基因的PX458質(zhì)粒同步轉(zhuǎn)染于另一盤細(xì)胞中，以有效監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。HOTTA等[28]在包裝CRISPR-sgRNA/ Cas9慢病毒試驗中，同樣以帶GFP的質(zhì)粒作為包裝轉(zhuǎn)染效率的質(zhì)控，并認(rèn)為當(dāng)293T細(xì)胞的發(fā)光比率達(dá)90%以上，慢病毒的包裝效率是有保障的[28]。本試驗選擇PX458（9.3 kb）作為病毒包裝時評估轉(zhuǎn)染效率的參照質(zhì)粒，雖然PX458的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)與lentiCRISPR v2的較相似，但質(zhì)粒大小有一定的差距（lentiCRISPR v2-sgRNA大小為12.9 kb），而質(zhì)粒大小對轉(zhuǎn)染效率有影響。因此，今后在開展類似的試驗時，應(yīng)采用片段大小更接近的質(zhì)粒作為對照，如lentiCRISPR v2GFP（Addgene編號：82416）片段大小為13.1 kb，更適用于本試驗監(jiān)控病毒包裝時的轉(zhuǎn)染效率。慢病毒離心法感染宿主細(xì)胞被證實可以提高感染效率5倍以上[29]，該方法無需通過價值昂貴的超速離心機濃縮病毒，無需測定慢病毒的滴度，直接取病毒溶液過濾后通過離心法感染細(xì)胞，使操作過程更簡便，只需一臺普通的溫控離心機即可開展。本試驗采用離心法也獲得了較好的感染效率，在一個T25培養(yǎng)瓶中找到了10余個克隆群。慢病毒針對不同細(xì)胞的感染效率有較大不同[30]。本試驗也嘗試用病毒上清液與細(xì)胞培養(yǎng)液1﹕1混合后（含6.0 μg·mL-1的polybrene）直接感染293T細(xì)胞和PFF細(xì)胞，293T細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素篩選3—4 d細(xì)胞可長滿，而PFF細(xì)胞無法獲得細(xì)胞群，這說明慢病毒對PFF細(xì)胞的感染效率遠(yuǎn)低于293T細(xì)胞（具體結(jié)果未展示）。

本試驗還利用RT-PCR檢測了打靶和對照組PFF細(xì)胞中的BMPR-IB、CylinD2、Cdk2、Bcl2、Cyp19a1基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示BMPR-IB基因被編輯之后，其表達(dá)量極顯著下調(diào)（檢測引物位于靶位點下游），同時CylinD2、Cdk2、Bcl2基因的表達(dá)量也極顯著下調(diào)，但Cyp19a1基因的表達(dá)量無顯著性差異。BMPR-IB基因的western blotting結(jié)果顯示，打靶細(xì)胞BMPR-IB蛋白表達(dá)量下降62%。眾所周知，細(xì)胞的增殖主要取決于細(xì)胞周期，尤其是哺乳動物細(xì)胞，G1/S、G2/M期在其增值過程中有著關(guān)鍵性的作用[31]。在哺乳動物細(xì)胞周期中，調(diào)節(jié)G1期的因子主要是D型的細(xì)胞周期蛋白（）和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（）。2在細(xì)胞周期起始以及從G1至S期均具有重要的調(diào)節(jié)作用[32]。BMPR-IB基因是BMPs的I型受體，其位于BMP-Smad信號傳導(dǎo)通路II型受體的下游，在配體結(jié)合后，I型受體被磷酸化激活，將信號傳導(dǎo)給下游信號載體蛋白，有利于細(xì)胞增殖信號的傳導(dǎo)。當(dāng)BMPR-IB基因被編輯后，BMP信號通路被阻斷，抑制了細(xì)胞增殖，從而引起了CylinD2、Cdk2基因的表達(dá)極顯著下調(diào)[13]。研究表明，Bcl-2基因家族在卵泡發(fā)育過程中對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)具有重要作用，ZHAO等[13]發(fā)現(xiàn)BMPR-IB基因被編輯后會促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡，使線粒體功能發(fā)生障礙，進(jìn)而極顯著下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)。19a1是芳香化酶的編碼基因，ZHAO等[13]發(fā)現(xiàn)BMPR-IB基因被編輯后會極顯著下調(diào)Cyp19a1基因的表達(dá)，而本試驗中該基因的表達(dá)并未出現(xiàn)顯著性改變（＞0.05），推測是由于不同細(xì)胞的BMP信號通路表達(dá)調(diào)控差異所造成。豬胎兒成纖維細(xì)胞中BMPR-IB基因被編輯使得CylinD2、Cdk2、Bcl2基因表達(dá)量極顯著下調(diào)，可能嚴(yán)重影響了豬胎兒成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，編輯BMPR-IB基因的PFF細(xì)胞傳代2—3次后，明顯出現(xiàn)細(xì)胞增殖緩慢、細(xì)胞形態(tài)變差的現(xiàn)象。CCK-8檢測結(jié)果也表明，打靶細(xì)胞隨著代數(shù)的增加其增殖水平極顯著下降（＜0.01，圖8）。

4 結(jié)論

利用慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)快速地獲得了編輯BMPR-IB基因的PFF細(xì)胞，打靶細(xì)胞突變率為70%；在所檢測的20個最可能的脫靶位點中，僅一個存在脫靶現(xiàn)象。研究顯示，BMPR-IB基因可能對BMPs信號通路中重要功能基因的表達(dá)和PFF細(xì)胞的增殖有重要的調(diào)節(jié)作用。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Targeted Editing of Bmpr-Ib Gene in Porcine Fetal Fibroblasts via Lentivirus Mediated Crispr/Cas9 Technology and Its Effects on Expression of Genes in the Bmps Signaling Pathway

YANG Qiang, XU Pan, JIANG Kai, QIAO ChuanMin, REN Jun, HUANG LuSheng, XING YuYun

(State Key Laboratory of Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045)

【】The aims of this study were to edit the BMPR-IB gene in pig fetal fibroblasts (PFF) via a lentivirus-mediated CRISPR/Cas9 genome editing technology, and toinvestigate its effects on expression of relevant functional genes in the bone morphogenetic proteins (BMPs) signaling pathway. 【】Twenty one single-guide RNAs (sgRNAs) targeting the eighth exon of porcine BMPR-IB gene were designed by the online software http://crispr.mit.edu. The sgRNA sequence with the highest score was selected for annealing with its complementary sequence (including adapters), and then the double-stranded DNA was ligated into the linearized lentiCRISPR v2, with the aim to obtain targeting plasmid. The targeting plasmid was mixed with packing vectors psPAX2 and pCMV-VSV-G at 5﹕4﹕1 molar ratio, then used to produce the recombinant lentivirus in 293T cells. To generate the induction mixture, the lentivirus supernatant was filtered through 0.45 μm, mixed with equal volume of fresh PFF growth medium, and finally polybrene was added to a final concentration of 6 μg·mL-1. PFF cells were infected in induction mixture and centrifuged at 1 000 g for 1 h at 32℃, then cultured in a 37℃incubator for 3 days. Three days post-transfection cells were selected with 3.5 μg·mL-1puromycin for 6-7 days, and resistant clones targetingwere expanded. Targeting cells were screened first by T7E1 digestion, and then the PCR and PCR-TA cloning were performed to confirm correct targeting. Quantitative real-time PCR was performed to detect the expression levels of relevant functional genes in BMPs signaling pathway. Protein expression of the BMPR-IB gene was detected by western blotting. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) kit was used to measure the proliferation capacity of targeted cells and control group cells. 【】Both T7E1 assay and PCR sequencing showed that the targeted region was successfully edited in targeted cells. TA cloning and sequencing revealed the desired insertion and deletion mutations in the targeted region, and the indels mutation rate was 70%. Moreover,only one off-target site (OTS) was detected among 20 potential ones, and an off-target rate of 10% was observed at this site. Quantitative real-time PCR results demonstrated that the expression levels of BMPR-IB, CylinD2, Cdk2 and Bcl2 genes were significantly (＜0.01) down-regulated in edited cells compared with wild-type cells. Western blotting results showed that the expression level ofin targeted cell was 38% of that in wild type cells. Cell proliferation assay revealed that the proliferation capacity of targeted cells was significantly lower than that of wild-type PFF cells of the same generation(＜0.01). Significant losses of proliferation capacity in targeted PFF cells were found following the cell passages (P5, P7 and P9); while there was no significant difference between passage 5 and passage 7 or 9 in control cells. This loss of proliferation capacity in targeted cells does not seem to be caused by the puromycin selection process, as control cells did not show the same loss when underwent the same process. 【】The lentivirus-mediated CRISPR/Cas9 system is efficient for targeted gene editing in PFF. The expression levels of relevant genes in BMPs signaling pathway were significantly down-regulated inedited cells, indicating thatplays an important role in regulating the proliferation of PFF cells.

Lentivirus;CRISPR/Cas9; porcine fetal fibroblasts;; off-target; cell proliferation

2017-03-02；

2018-02-02

國家自然科學(xué)基金（31560304）、國家科技重大專項（2016ZX08006-003）

楊強，E-mail：626818972@qq.com。

幸宇云，Tel/Fax：0791-83813080；E-mail：xingyuyun9@hotmail.com