閻依超，萬春雁，古咸彬，郭成寶，陳月紅，高志紅

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過量表達對草莓果實品質及相關基因的影響

閻依超1，萬春雁2，古咸彬1，郭成寶3，陳月紅3，高志紅1

（1南京農業(yè)大學，南京 210095；2江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農業(yè)科學研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212400；3南京市農業(yè)科學研究所，南京 210000）

【】研究外源基因轉入對‘紅頰’草莓果實品質及相關基因表達的影響，揭示在草莓果實品質調控中的作用及分子機理。【】以5個轉株系及非轉基因‘紅頰’草莓全紅期果實為材料，測定果實縱橫徑、單果重、可溶性糖、可溶性蛋白、抗壞血酸等風味物質及花青苷、總黃酮、總酚等著色物質的含量。應用BLASTn、GENEFINDER和PlantCARE等生物信息學方法分析外源基因和7個次生代謝產物合成途徑相關基因（、、、、、、和）的結構，并預測基因啟動子作用元件。采用qRT-PCR定量法檢測相關基因表達量，應用7300 system軟件和2-△△Ct法分析數據。對生理生化及分子數據進行方差及相關性分析，綜合討論的轉入對‘紅頰’草莓果實品質及相關基因表達的影響?！尽哭D基因‘紅頰’草莓株系與野生型果實單果重的范圍為11.75—15.42 g，縱徑和橫徑的范圍分別為35.12—40.42 mm及28.73—32.6 mm，僅株系8果實縱徑顯著大于株系7，其余指標間差異不顯著。其中轉基因株系1和7的花青苷含量顯著高于野生型；轉基因株系1、7及8總黃酮含量顯著高于野生型；各轉基因株系的總酚含量均顯著高于野生型。轉基因株系1、7和8果實的可溶性糖含量顯著高于野生型（21.70 mg·g-1FW），分別為野生型的2.87、3.39和3.35倍。可溶性固形物含量與可溶性糖含量呈正相關（=0.811*），但樣品果實的可溶性固形物含量間不存在顯著性差異。轉基因株系草莓成熟果實果肉中氨基酸含量為0.2580—0.3950 g/100 g FW，野生型果實的氨基酸含量為0.5151 g/100 g FW，顯著高于各轉基因株系草莓果實；轉基因株系1和7的可滴定酸含量顯著高于野生型；轉基因株系1果實的抗壞血酸含量為168.35 mg/100 g FW，顯著高于野生型（92.50 mg/100 g FW）。轉基因株系9及10果實的可溶性蛋白含量分別為25.97和25.86 mg·g-1FW，顯著高于野生型（22.93 mg·g-1FW）。（cinnamoyl-CoA reductase 2-like）和（myb-related protein 306）在各轉基因株系中表達量顯著高于野生型。分析發(fā)現差異表達基因啟動子區(qū)域包含多種高等植物順勢調控元件，主要有對真核生物起增強基因轉錄效率的CAAT-box和核心啟動子元件TATA-box。同時還包含G-Box、G-box、MBS、ARE、5UTR Py-rich stretch等能影響各基因對光的響應、在苯丙烷代謝途徑中起調節(jié)作用的順式作用元件?！尽空{控相關基因參與轉化體果實發(fā)育和成熟，提高光的有效性，活化黃酮類生物合成通路關鍵基因，差異基因中均包含大量光誘導響應元件，及的表達促進了總黃酮、酚類物質及花青苷等次生代謝物的合成。轉入使草莓果實的多項營養(yǎng)成分和著色物質含量顯著增加，改善了草莓的果實品質。

草莓；；過量表達；果實品質；啟動子

0 引言

【研究意義】草莓（Duch）為薔薇科（Rosaceae）草莓屬（）多年生草本植物，分布范圍較廣，果實營養(yǎng)價值和經濟價值較高。在溫度較低的冬春季節(jié)，低溫是制約其產量和品質的主要因素，草莓能否安全越冬及培育耐寒品種是生產上急需解決的問題[1]。轉擬南芥的研究中，成功培育出具抗寒特性的轉基因株系[2]。但耐寒品種除了要增強其抗寒性外，還需要保持果實原有的品質。果實色澤，是外觀品質重要指標之一，且著色程度與果實風味品質密切相關。影響著色的物質主要有花青苷、黃酮類化合物和酚類物質，色素的積累是色澤形成的基礎。其中花青苷的積累水平能夠評價果實品質及成熟度，還能提供有益健康的元素，具有營養(yǎng)藥理價值[3]?！厩叭搜芯窟M展】CBF/DREB轉錄因子屬于AP2/EREBP轉錄因子家族，通常認為其能識別并結合順式作用元件，參與對低溫、高鹽和干旱等的分子應答。近年來也有研究指出，番茄中的過量表達能夠誘導果實成熟相關基因的表達，如、、等果實軟化相關基因、和等色素合成相關基因，并且調控果實發(fā)育和植物生長代謝[4]。將HB柚中的在番茄（）中超表達后發(fā)現，35S-line5和35S-line19果實大小及單果重顯著小于野生型，且轉基因株系果實中有機酸、糖類和脂肪酸含量顯著高于野生型番茄的含量，表明在果實成熟過程中起調控初生代謝物含量的重要作用[5]。研究香蕉（）后發(fā)現，、、及在香蕉果實成熟過程中起調控作用，在乙烯誘導成熟香蕉中、、及的表達量都隨著乙烯量的增加、果實成熟而不斷升高[6]。甜瓜中的能與識別并結合GCCGAC序列，意味著DREB轉錄因子能夠通過調節(jié)乙烯生物合成來調控乙烯形成[7]。將油椰子（）中轉入番茄中發(fā)現，果實中該基因的表達與乙烯、脫落酸合成及果實成熟相關[8]?！颈狙芯壳腥朦c】大量研究表明，DREB轉錄因子能夠提高植物對非生物逆境的抗性，但其轉入后對轉基因草莓果實的影響鮮有研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究以草莓品種‘紅頰’及其轉株系為試材，對全紅期的成熟果實中酚類物質、總黃酮、花青苷含量等著色物質及可溶性固形物、可溶性糖、維生素C含量、可滴定酸等風味物質進行分析，并對轉錄水平下差異基因的表達及差異基因的啟動子進行初步研究，為調控草莓果實品質提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗于2017年1—4月在南京農業(yè)大學果樹生物技術實驗室進行。

1.1 試驗材料

試驗材料為通過潮霉素抗性篩選及分子檢測的轉水稻草莓株系[9]及‘紅頰’草莓。采收全紅期（轉紅著色面積達到100%）轉株系及‘紅頰’草莓果實各10個，去除果皮及種子，取65 g混合均勻的皮下2 mm厚果肉，根據各試驗用量分裝后液氮速凍，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫▓D1）。

圖1 野生型及轉RdreB1BI‘紅頰’草莓全紅期果實

1.2 果實大小及單果重的測定

隨機選取10個全紅期草莓果實，用天平稱單果重，用手持式游標卡尺測出縱、橫徑，并記錄數據。

1.3 花青苷含量的測定

參照Wrolstadde[10]的方法，用pH差示法測定花青苷含量，取5 g速凍樣品，重復取樣3次，分別加入10 mL 1% HCl研磨，沖洗研缽并定容至25 mL，12 000 r/min離心20 min，取上清至25 mL容量瓶，浸提至無色過濾后取濾液，定容至25 mL避光待測。分別用緩沖溶液和一水檸檬酸及十二水合磷酸氫二鈉緩沖溶液混勻反應完全后，在510 nm波長下測定光密度值，重復測定3次。

1.4 氨基酸含量的測定

參照楊遠帆等[11]的方法并稍作修改，用茚三酮法測定氨基酸含量，取1 g速凍樣品，重復取樣3次，分別加入5 mL 80%乙醇研磨，80℃水浴浸提30 min，冷卻后10 000 r/min離心30 min，沉淀加入80%乙醇重復上述操作，提取液用80%乙醇定容至25 mL。取1 mL于10 mL刻度試管中，加2 mL含茚三酮的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液及7 mL蒸餾水混勻，80℃水浴30 min，冷卻后用蒸餾水定容至15 mL，以蒸餾水為對照，在570 nm波長下測定光密度值。

1.5 總酚含量的測定

參考DJERIDANE等[12]的方法并稍作修改，取1.5 g速凍樣品，重復取樣3次，分別加入10 mL 80%乙醇及1 mL 10%三氯酸研磨，勻漿轉入15 mL容量瓶，用80%乙醇定容靜置30 min。過濾后吸取1 mL濾液，加5 mL蒸餾水試劑，1 mL FC顯色劑及3 mL 7.5%碳酸鈉溶液，混勻，常溫靜置2 h后，以蒸餾水為對照，在765 nm波長下測定光密度值，以沒食子酸作標準曲線，計算其含量，單位為mg?g-1。

1.6 總黃酮含量的測定

參照藥典[13]的方法并改進，取2 g速凍樣品，重復取樣3次，分別加入16 mL 95%乙醇研磨，浸提后過濾，取1 mL濾液置10 mL試管，用70%乙醇補至5 mL，然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，混勻放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，混勻放置6 min，再加4% NaOH溶液2 mL，混勻放置10 min后，以蒸餾水為對照，在510 nm波長下測定光密度值。以蘆丁標準品作標準曲線，計算其含量，單位為mg?g-1。

1.7 可溶性糖、可溶性蛋白及可溶性固形物含量的測定

蒽酮比色法測定可溶性糖含量[14]，考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白質含量[14]，阿貝折射儀測定果實可溶性固形物含量。

1.8 總酸及抗壞血酸含量的測定

采用2,6-二氯酚靛酚滴定法測定抗壞血酸含量，采用NaOH滴定法測定總酸含量[14]。

1.9 轉錄水平差異表達基因分析

1.9.1 總RNA的提取及cDNA的合成 取全紅期轉株系及‘紅頰’草莓果實，采用改良CTAB法[14]提取草莓果實RNA。cDNA合成根據qPCR RT試劑盒（TaKaRa）說明書進行。將合成的cDNA用TE緩沖液稀釋到統(tǒng)一濃度后，保存至-20℃冰箱備用。

1.9.2 轉錄水平差異基因實時熒光定量PCR分析 在對轉基因株系果實及野生型‘紅頰’草莓果實進行轉錄組數據分析后，得到6個差異表達基因[9]。以轉基因草莓株系及未轉基因草莓果實cDNA為模板，以草莓保守作為內參基因[15]，為目的基因，轉錄水平差異基因為待測基因，分別設計引物。外源及內參基因的熒光定量引物見表1。

采用熒光定量PCR法測定基因表達量，PCR反應體系為：cDNA模板（50 ng?μL-1）1 μL，SYBR? Premix Ex Taq?（TaKaRa）10 μL，上、下游引物（10 mmol?μL-1）各0.2 μL，RNase Free ddH2O加至20 μL。每個樣品設3次重復。PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，40個循環(huán)。反應結束后，在60℃進行熒光信號采集，繪制溶解曲線。數據分析采用7300 system軟件和2-△△Ct方法。

1.10 數據處理

采用Microsoft Excel 2016計算試驗數據標準曲線及平均值，并用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，在＜0.05水平及＜0.01水平對試驗結果進行方差分析，Tukey HSD多重比較和相關性分析，所有試驗設3次重復。

1.11 啟動子序列分析

根據已知的差異表達基因，在草莓數據庫中通過BLAST找到該基因ATG前約2 000 bp左右的片段，再利用GENEFINDER、PlantCARE等網站對序列進行預測分析，預測該片段是否為啟動子區(qū)域，以及啟動子可能包含的順式作用元件。

表1 熒光定量引物設計

2 結果

2.1 RdreB1BI表達對果實大小的影響

如表2所示，各轉基因‘紅頰’草莓株系與野生型果實單果重的范圍為11.75—15.42 g，縱徑和橫徑的范圍分別為35.12—40.42 mm及28.73—32.6 mm，僅株系8果實縱經顯著大于株系7，其余指標間差異不顯著。

表2 野生型與轉基因各株系草莓果實大小指標

同列中不同字母表示處理間差異顯著（＜0.05）。下同

Different letters in the same column are significantly different at＜0.05. The same as below

2.2 RdreB1BI表達對著色物質的積累

如表3所示，株系1及7全紅期果實果肉的花青苷含量分別為100.74、104.09 μg?g-1，顯著高于野生型；株系1、7及8總黃酮含量分別為788.30、921.97和1 040.22 μg?g-1，顯著高于野生型；各株系的總酚含量顯著或極顯著高于野生型，分別為10.87、8.66、9.17、5.26及5.38 mg?g-1（＜0.05及＜0.01）。

隨著果實的生長發(fā)育，在全紅期時，花青苷累積至一定程度后，其合成速率下降，并且底物開始轉化合成酚類物質和總黃酮，而總黃酮同時也在酶的催化下作用，不斷轉化形成花青苷。較高的酚類物質及總黃酮含量，能夠延緩果實的衰老。

2.3 RdreB1BI表達對風味物質的積累

如表4所示，各轉基因株系草莓成熟果實果肉中可溶性固形物、可溶性糖含量的范圍分別為7.53%—11.53%和17.51—73.6 mg?g-1FW，轉基因株系1和7的可溶性固形物含量顯著高于株系10，轉基因株系1、7及8可溶性糖含量為62.35、73.6和72.8 mg?g-1FW，顯著高于野生型的21.70 mg?g-1FW，為野生型的2.87、3.39和3.35倍，其中轉基因株系7可溶性糖的含量最高（＜0.05）?？扇苄怨绦挝锖颗c可溶性糖含量之間的相關系數為0.811，且其在雙側顯著性0.05上顯著，因此可溶性固形物含量與可溶性糖含量之間存在顯著正相關性。

表3 野生型和轉基因株系草莓果實中色素含量

同列中不同大寫字母表示處理間差異極顯著（＜0.01）

Different capital letters in the same column are extremely significant difference at＜0.01

各轉基因株系草莓成熟果實果肉的氨基酸含量為0.2580—0.3950 g/100 g FW，野生型果實的氨基酸含量為0.5151 g/100 g FW，顯著高于各轉基因株系草莓果實，分別為其1.3、1.43、1.33、1.82和2倍；樣品果肉的可滴定酸及抗壞血酸含量分別在0.7595%—1.1333%和92.50—168.35 mg/100 g FW，轉基因株系1、7的可滴定酸含量為1.1333%和1.0664%，顯著高于野生型的0.8147%；轉基因株系1的抗壞血酸含量為168.35 mg/100 g FW，顯著高于野生型的92.50 mg/100 g FW，且各轉基因株系果實的抗壞血酸含量分別為野生型的1.82、1.26、1.23、1.21和1.35倍，其中轉基因株系1的可滴定酸及抗壞血酸含量最高（＜0.05）。

進一步對供試樣品中可溶性蛋白含量進行檢測，分析后發(fā)現各轉基因株系草莓成熟果實果肉 中可溶性蛋白含量在轉基因株系9及10果實的含量分別為25.97和25.86 mg?g-1FW，顯著高于野生型（＜0.05）。

表4 野生型和轉基因株系草莓果實中營養(yǎng)成分含量

2.4 RdreB1BI及轉錄差異基因表達分析

利用qRT-PCR技術對及轉錄差異基因在全紅期果實中的表達情況進行分析（圖2）。結果表明，與野生型相比，在各株系轉基因草莓果實中的表達量顯著高于野生型，分別為野生型的263.9、233.3、386.9、153.3和58.53倍（圖2-Ⅰ）。

研究發(fā)現，外源的轉入，調控了一系列與成熟、代謝、色素合成、花芽分化等相關的基因表達。為進一步分析轉入‘紅頰’草莓后，對其果實發(fā)育的調控作用，對轉錄組分析差異表達基因進行分析。（cinnamoyl-CoA reductase 2-like）在各轉基因株系中表達量分別為野生型的8.798、3.305、5.071、1.557和2.522倍，株系1及8與野生型存在顯著差異（圖2-Ⅱ）。（myb- related protein 306）在株系1、8、9及10的表達量顯著高于野生型，表達量分別為野生型的1.674、1.862、4.279、1.735倍（圖2-Ⅲ）。轉基因株系8的全紅期果實中（cinnamate-4- hydroxylase）表達為野生型的2.127倍，差異顯著（圖2-Ⅳ）。（dihydroflavonol 4-reductase）在野生型果實中的表達顯著高于株系1、9及10（圖2-Ⅴ）；（WD repeat-containing protein LWD1-like）、（naringenin, 2-oxoglutarate 3-dioxygenase）和（probable glutathione S-transferase）在野生型果實中的表達顯著高于各株系（圖2-Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ）。

2.5 轉錄差異表達基因啟動子初步分析

根據二倍體草莓參考基因組數據庫，預測差異表達基因的啟動子序列，運用PlantCARE（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對差異表達基因啟動子區(qū)域調控元件進行分析。如表5所示，發(fā)現其啟動子區(qū)域包含多種高等植物順勢調控元件，主要有對真核生物起增強基因轉錄效率的CAAT-box和核心啟動子元件TATA-box。同時還包含在基因轉錄過程中起重要調節(jié)作用的順式作用元件G-Box、G-box、MBS、ARE、5UTR Py-rich stretch，影響各基因對光的響應，在苯丙烷代謝途徑中起調節(jié)作用。

運用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）對起始密碼子上游長度為1 500 bp的啟動子區(qū)域進行分析，結果表明，除含有核心啟動子元件CAAT-box和TATA-box元件外，還包含3個ARE抗氧化反應元件、1個AT-rich element ATBP-1結合相關元件、1個CAT-box分生組織特異性元件、1個CGTCA-motif茉莉酸響應有關的順式調節(jié)元件、2個GARE-motif 赤霉素響應元件、1個GC-motif厭氧反應順式作用元件、3個MBS干旱誘導響應元件，MYB結合位點、1個Skn-1_motif胚乳表達所需元件、1個TC-rich repeats防御與脅迫響應元件、1個TGA-element生長素響應元件、1個TGACG-motif茉莉酸甲酯響應及大量光響應元件等多種順式作用元件。對啟動子序列進行分析后發(fā)現，其包含大量與相同的元件外，還存在1個RY-element種子特異性表達元件、1個5UTR Py-rich stretch高水平轉錄調控因子及Box 4、Box I、I-box、as-2-box等保守光調控及光感應順式作用元件（表5）。

圖2 RdreB1BI及轉錄差異基因的相對表達量

3 討論

極低的乙烯釋放量能夠催化草莓果實中花青苷的合成，增加總糖含量，并調控果實成熟進程中風味、質地、色澤等果實品質[16-17]。已有研究表明，DREB轉錄因子能夠調節(jié)乙烯生物合成來調控乙烯形成。本研究結果表明，表達量和總黃酮、總酚、花青苷、可溶性固形物及可溶性糖含量呈正相關，說明在轉化體中的表達能夠調控果實品質，與前人研究結果一致。

表5 差異表達基因啟動子區(qū)的順式作用元件序列、來源、特性及分布

的表達可能促進植物體內酚類物質和木質素的合成，增強植物抵御生物與非生物脅迫的能力[18-20]。轉基因楊樹中下調能夠通過調控可發(fā)酵糖的含量來促進木質生長[21]。高粱中比更能激活對香豆酰-輔酶A產生木質素以抵御病菌脅迫，提高植株對生物逆境的抗性[22]。玉米突變體中木質素單體與阿魏酸結合形成木質素，并提供生物燃料底物[23]。在擬南芥[24]、三葉草[25]、洋蔥[26]、蘋果[27]等植物的研究中發(fā)現，R2R3-MYB蛋白中的Sg6亞家族能夠激活花青苷結構基因，調控合成并積累花青苷[28-29]。轉大豆煙草中的類黃酮含量顯著增加[30-31]。R2R3-MYB蛋白中的Sg4亞家族中，超表達蘋果煙草中花青苷及總黃酮的合成受到催化，花色變深[32]。草莓中研究較少，煙草的表達與程序性細胞死亡相關，其可能阻止程序性細胞死亡并協(xié)調植株對非生物逆境的抗性[33]。金魚草中能夠激活、和啟動子的轉錄[34]。有研究指出，的表達參與調控了諸如花青苷合成等生理代謝[35]。是木質素合成途徑的上游基因，是木質素合成途徑的下游基因[36]。和在成熟期‘麗江山荊子’果肉中表達量最低[37]。由本研究可知，轉草莓全紅期果實中、及表達量顯著低于野生型，與總黃酮、總酚類及花青苷含量存在相關性；和的表達顯著高于野生型，且分別與總黃酮、總酚類及花青苷含量呈正相關（=0.584，0.921*，0.704；=0.310，0.585，0.314）。花青苷合成相關的結構基因在野生型、轉基因株系7和8全紅期果實中的表達量顯著高于株系1、9和10，但株系1的花青苷含量卻顯著高于株系8及野生型。在蘋果果皮[38]和荔枝果皮[39]的研究中發(fā)現，活性與花青苷的積累趨勢不一致。本研究相關性分析發(fā)現，在轉草莓株系中的表達量與花青苷含量呈正相關（=0.249），但不存在顯著性，說明果實花青苷的含量與活性沒有密切關系。花青苷合成相關結構基因在野生型全紅期果實中的表達量顯著高于轉基因株系，但野生型的花青苷含量卻顯著低于轉基因株系。獼猴桃中的表達變化與果皮著色趨勢不具有一致性，的表達與著色存在對應關系，可見在花青素合成途徑中同一催化酶可能存在不同轉錄本[40]。本研究中的表達量與總黃酮、總酚和花青苷含量呈負相關。這些調控差異說明，次生代謝物合成過程具有復雜的機制，同家族不同基因在功能上存在差異，具體影響有待進一步研究，由此推測轉基因植株中的花青素苷的合成與和不存在顯著相關性。

從本研究可知，轉基因株系中包含大量光誘導響應元件的及上調表達，促進了碳水化合物的吸收，提高了果實中可溶性糖含量。黃酮類生物合成和光合作用通路是果實著色過程中主要的影響因子[41]，含大量光誘導響應元件基因的表達促進相關物質合成，使轉草莓果實的風味物質含量及色澤品質優(yōu)于野生型。說明外源的轉入能夠提高光的有效性，活化及的表達，以促進著色物質在果實中的形成及積累，與前人研究一致。已有研究表明DREB轉錄因子能夠調控乙烯形成，催化初生及次生代謝物的合成，并且光照還能進一步影響可溶性蛋白、糖、抗壞血酸等初生代謝物合成。乙烯可能與光一同調控增加了轉果實中可溶性糖、花青苷等風味、色澤物質含量。調控相關基因參與轉化體發(fā)育和成熟的進程，為深入揭示功能及草莓果實成熟調控的因子及分子機理提供了理論參考。

4 結論

轉株系與野生型草莓果實的花青苷、總黃酮及總酚含量存在顯著差異?？扇苄怨绦挝锖颗c可溶性糖含量成正比，轉基因株系果實的可溶性糖含量顯著高于野生型。轉基因株系草莓成熟果實果肉的氨基酸含量顯著高于轉基因株系；轉基因株系1和7果實的可滴定酸含量、轉基因株系1果實的抗壞血酸含量、轉基因株系9及10果實的可溶性蛋白含量顯著高于野生型。在轉基因株系草莓果實中的表達量顯著高于野生型；和在轉基因株系中表達顯著高于野生型。差異表達基因啟動子區(qū)域包含多種高等植物順勢調控元件，主要有對真核生物起到增強基因轉錄效率的CAAT-box和核心啟動子元件TATA-box。同時還包含G-Box、G-box、MBS、ARE、5UTR Py-rich stretch等能影響各基因對光的響應及在苯丙烷代謝途徑中起調節(jié)作用的順式作用元件。調控相關基因參與轉化體果實發(fā)育和成熟，提高光的有效性，活化黃酮類生物合成通路關鍵基因，差異基因中均包含大量光誘導響應元件，及的表達促進了總黃酮、酚類物質及花青苷等次生代謝物的合成。外源的轉入促進著色物質在果實中的形成與積累。

[1] 張勇, 湯浩茹, 羅婭, 王小蓉, 陳清, 劉澤靜. 草莓基因的克隆及表達分析. 園藝學報, 2014, 41(2): 240-248.

ZHANG Y, TANG H R, LUO Y, WANG X R, CHEN Q, LIU Z J. Isolation and expression analysis of a CRT/DRE-binding factor genefrom., 2014, 41(2): 240-248. (in Chinese)

[2] Bajwa V S, Shukla M R, Sherif S M, Susan J M, Praveen K S. Role of melatonin in alleviating cold stress in., 2014, 56(3): 238-245.

[3] 趙佳, 劉榮, 楊帆, 李鑫, 劉厚生, 嚴倩, 肖月華. 月季花青素苷相關R2R3-MYB蛋白基因的克隆和表達分析. 中國農業(yè)科學, 2015, 48(7): 1392-1404.

ZHAO J, LIU R, YANG F, LI X, LIU H S, YAN Q, XIAO Y H. Cloning and expression analysis of R2R3-MYB genes related to anthocyanin biosynthesis in rose., 2015, 48(7): 1392-1404. (in Chinese)

[4] 李辰, 范意娟, 紀文龍, 魏靈芝, 姜金鑄, 李冰冰, 賈文鎖.過量表達可促進番茄果實發(fā)育及成熟. 中國農業(yè)大學學報, 2014, 19(3): 73-79.

LI C, FAN Y J, JI W L, WEI L Z, JIANG J Z, LI B B, JIA W S. Over-expression ofpromotes fruit development and ripening in ‘Micro-Tom’ plant., 2014, 19(3): 73-79. (in Chinese)

[5] Nishawy E, Sun X, Ewas M, Ziaf K, Xu R, Wang D, Amar M, Zeng Y, Cheng Y. Overexpression ofDREB gene in tomato affects fruit size and accumulation of primary metabolites., 2015, 192: 460-467.

[6] KUANG J F, CHEN J Y, LIU X C, HAN Y C, XIAO Y Y, SHAN W, TANG Y, WU K Q, HE J X, LU W J. The transcriptional regulatory network mediated by banana () dehydration- responsive element binding () transcription factors in fruit ripening., 2017, 214(2): 762-781.

[7] MIZUNO S, HIRASAWA Y, SONODA M, NAKAGAWA H, SATO T. Isolation and characterization of three DREB/ERF-type transcription factors from melon ()., 2006. 170(6): 1156-1163.

[8] EBRAHIMI M, ABDULLAH S N, ABDUL AZIZ M, NAMASIVAYAM P. Oil palmconferred stress tolerance in transgenic tomato plants through modulation of the ethylene signaling pathway., 2016, 202: 107-120.

[9] GU X, CHEN Y, GAO Z, QIAO Y, WANG X. Transcription factors and anthocyanin genes related to low-temperature tolerance intransgenic strawberry., 2015, 89: 31-43.

[10] WROLSTAD R E, CULBERTSON J D, CORNWELL C J, MATTICK L R. Detection of adulteration in blackberry juice concentrates and wines., 1982, 65(6): 1417-1423.

[11] 楊遠帆, 倪輝, 吳黎明. 茚三酮法測定蜂蜜及果葡糖漿中的氨基酸含量. 中國食品學報, 2013, 13(2): 171-176.

YANG Y F, NI H, WU L M. Determination of Amino ACID in honey and high fructose corn syruo (HFCS) by the method of ninhydrin colorization., 2013, 13(2): 171-176. (in Chinese)

[12] DJERIDANE A, YOUSFI M, NADJEMI B, BOUTASSOUNA D, STOCKER P, VIDAL N. Antioxidant activity of some Algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds., 2006, 97(4): 654-660.

[13] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部).北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.

Chinese Pharmacopoeia Commission.. Beijing: China Medical Science Press, 2010. (in Chinese)

[14] 蔡慶生. 植物生理學實驗. 北京: 中國農業(yè)大學出版社, 2013.

CAI Q S.. Beijing: China Agricultural University Press, 2013. (in Chinese)

[15] BLANCH M, ROSALES R, PALMA F, SANCHEZ-BALLESTA M T, ESCRIBANO M I, MERODIO C. CO2-driven changes in energy and fermentative metabolism in harvested strawberries., 2015, 110: 33-39.

[16] VILLARREAL N M, BUSTAMANTE C A, CIVELLO P M, MARTíNEZ G A. Effect of ethylene and 1-MCP treatments on strawberry fruit ripening., 2010, 90(4): 683-689.

[17] TRAINOTTI L, PAVANELLO A, CASADORO G. Different ethylene receptors show an increased expression during the ripening of strawberries: Does such an increment imply a role for ethylene in the ripening of these non-climacteric fruits?, 2005, 56(418): 2037-2046.

[18] LAUVERGEAT V, LACOMME C, LACOMBE E, LASSERRE E, ROBY D, GRIMA-PETTENATI J. Two cinnamoyl-CoA reductase (CCR) genes fromare differentially expressed during development and in response to infection with pathogenic bacteria., 2001, 57(7): 1187-1195.

[19] DERIKVAND M M, SIERRA J B, RUEL K, POLLET B, DO C T, THéVENIN J, BUFFARD D, JOUANIN L, LAPIERRE C. Redirection of the phenylpropanoid pathway to feruloyl malate inmutants deficient for cinnamoyl-CoA reductase 1., 2008, 227(5): 943-956.

[20] ZHOU R, JACKSON L, SHADLE G, NAKASHIMA J, TEMPLE S, CHEN F, DIXON R A. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in., 2010, 107(41): 17803-17808.

[21] VAN ACKER R, LEPLE J C, AERTS D, STORME V, GOEMINNE G, IVENS B, LEGEE F, LAPIERRE C, PIENS K, VAN MONTAGU M C E, SANTORO N, FOSTER C E, RALPH J, SOETAERT W, PILATE G, BOERJAN W. Improved saccharification and ethanol yield from field-grown transgenic poplar deficient in cinnamoyl-CoA reductase., 2014, 111(2): 845-850.

[22] SATTLER S A, WALKER A M, VERMERRIS W, SATTLER S E, KANG C. Structural and biochemical characterization of cinnamoyl- CoA reductases., 2017, 173(2): 1031-1044.

[23] SMITH R A, CASS C L, MAZAHERI M, SEKHON R S, HECKWOLF M, KAEPPLER H, LEON N, MANSFIELD S D, KAEPPLER S M, SEDBROOK J C. Suppression ofincreases the level of monolignol ferulates incorporated into maize lignins., 2017, 10(1): 109.

[24] TOHGE T, NISHIYAMA Y, HIRAI M Y, YANO M, NAKAJIMA J, AWAZUHARA M, INOUE E, TAKAHASHI H, GOODENOWE D B, KITAYAMA M. Functional genomics by integrated analysis of metabolome and transcriptome ofplants over-expressing an MYB transcription factor., 2005, 42(2): 218-235.

[25] ALBERT N W, GRIFFITHS A G, COUSINS G R, VERRY I M, WILLIAMS W M.Anthocyanin leaf markings are regulated by a family ofgenes in the genus., 2015, 205(2): 882-893.

[26] Kathy E S, Hanh N, Fernand K, David A B, Nick W A, John A M, Meeghan P J, Ross N C, Colin E, Kevin M D. The onion (L.)generegulates anthocyanin biosynthesis., 2016, 7: 1865.

[27] WANG N, XU H, JIANG S, ZHANG Z, LU N, QIU H, QU C, WANG Y, WU S, CHEN X. MYB12 and MYB22 play essential roles in proanthocyanidin and flavonol synthesis in red-fleshed apple (f.)., 2017, 90(2): 276-292.

[28] BUER C S, IMIN N, DJORDJEVIC M A. Flavonoids: New roles for old molecules., 2010, 52(1): 98-111.

[29] KOES R, VERWEIJ W, QUATTROCCHIO F. Flavonoids: A colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways., 2005, 10(5): 236-242.

[30] 楊文杰, 杜海, 方芳, 楊婉身, 吳燕民, 唐益雄. 大豆兩個MYB 轉錄因子基因的克隆及表達分析. 中國農業(yè)科學, 2008, 41(4): 961-970.

YANG W J, DU H, WAN F, YANG W S, WU Y M, TANG Y X. Cloning and characterization of two new MYB transcription factor genes from soybean., 2008, 41(4): 961-970. (in Chinese)

[31] 楊文杰, 吳燕民, 唐益雄. 大豆轉錄因子基因的表達及功能分析. 遺傳, 2009, 31(6): 645-653.

YANG W J, WU Y M, TANG Y X. Expressing and functional analysis offrom soybean., 2009, 31(6): 645-653. (in Chinese)

[32] Vimolmangkang S, Han Y, Wei G, KORBAN S S. An apple MYB transcription factor,, is involved in regulation of anthocyanin biosynthesis and flower development., 2013, 13(1): 176.

[33] BAHIELDIN A, ATEF A, EDRIS S, GADALIA N O, ALI H M. Ethylene responsive transcription factor ERF109 retards PCD and improves salt tolerance in plant., 2016, 16(1): 216.

[34] MOYANO E, MARTINEZ-GARCIA J F, MARTIN C. Apparent redundancy in MYB gene function provides gearing for the control of flavonoid biosynthesis in antirrhinum flowers., 1996, 8(9): 1519-1532.

[35] Jackson D, Martin C. Expression patterns of MYB genes fromflowers., 1991, 3(2): 115-125.

[36] 黃杰恒, 李威, 曲存民, 劉列釗, 徐新福, 王瑞, 李加納. 甘藍型油菜不同抗倒性材料中木質素代謝途徑關鍵基因表達特點. 作物學報, 2013, 39(8): 1339-1344.

HUANG J H, LI W, QU C M, LIU L Z, XU X F, WANG R, LI J N. Expression characteristics of key genes in lignin pathway among different lodging resistance lines ofL., 2013, 39(8): 1339-1344. (in Chinese)

[37] 周蘭. 蘋果果實發(fā)育中類黃酮含量變化及相關基因的研究[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2013.

ZHOU L. Study on the concentration changes and related genes of flavonoids in apple [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2013. (in Chinese)

[38] JU Z G, YUAN Y B, LIU C L, WANG Y Z, TIAN X P. Dihydroflavonol reductase activity and anthocyanin accumulation in ‘Delicious’, ‘Golden Delicious’ and ‘Indo’ apples., 1997, 70(1): 31-43.

[39] 王惠聰, 黃旭明, 胡桂兵, 黃輝白. 荔枝果皮花青苷合成與相關酶的關系研究. 中國農業(yè)科學, 2004, 37(12): 2028-2032.

WANG H C, HUANG X M, HU G B, HUANG H B. Studies on the relationship between anthocyanin biosynthesis and related enzymes in litchi pericarp., 2004, 37(12): 2028-2032. (in Chinese)

[40] Montefiori M, Espley R V, Stevenson D, Cooney J, Datson P M, Saiz A, Atkinson R G, Hellens R P, Allan A C.Identification and characterisation ofand, two glycosyltransferases responsible for anthocyanin biosynthesis in red-fleshed kiwifruit ()., 2011, 65(1): 106-118.

[41] 何平, 李林光, 王海波, 常源升, 李慧峰. 遮光性套袋對桃果實轉錄組的影響. 中國農業(yè)科學, 2017, 50(6): 1088-1097.

HE P, LI L G, WANG H B, CHANG Y S, LI H F. Effects of shading fruit with opaque paper bag on transcriptome in peach., 2017, 50(6): 1088-1097. (in Chinese)

（責任編輯 趙伶俐）

Effect ofGene Overexpression on Fruit Quality and Related Gene Expression in Strawberry

YAN YiChao1, WAN ChunYan2, GU XianBin1, GUO ChengBao3, CHEN YueHong3, GAO ZhiHong1

(1Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Zhenjiang Institute of Agricultural Science, Zhenjiang 212400, Jiangsu;3Nanjing Institute of Agricultural Science, Nanjing 210000)

【】The effect of exogenoustransformation to the fruit quality and related gene expression in ‘Benihoppe’ strawberry were analyzed to reveal the function and molecular mechanism of quality regulation in transgenic strawberry fruit.【】The edible organs on fivetransgenic strawberry lines and non-transgenic ‘Benihoppe’ strawberries (fruits in full red stage) were used as material to test and determine the vertical diameter, transverse diameter, weight, contents of flavor substance (soluble sugar, soluble protein, ascorbic acid) and coloring materials (anthocyanin, flavonoids and total phenol). The structure of the exogenous gene and seven secondary metabolites synthesis pathway-related genes (,,,,,,and) and the elements of gene promoter were analyzed and were predicted by bioinformatics methods such as BLASTn, GENEFINDER, and PlantCARE. The expression of related genes was detected by qRT-PCR. The data were analyzed by 7300 system software and 2-△△Ctmethod. The variance and correlation analysis of physiological, biochemical and molecular data were analyzed. The effects ofon the fruit quality and related gene expression of ‘Benihoppe’ strawberry were discussed comprehensively. 【】The fresh weight of transgenic and non-transgenic strawberries was ranging from 11.75 to 15.42 g. The vertical andtransverse diameters were ranging from 35.12 to 40.42 mm and 28.73 to 32.6 mm, respectively.Only the volume diameter of transgenic line 8 was significantly higher than that of line 7, and there were no significant differences between the other samples. The contents of anthocyanin in line 1 and line 7 were significantly higher than those of the control. The contents of total phenol in transgenic line1 and line 7 were significantly higher than that in control. The contents of total phenol in each line were significantly higher than that in the control. The soluble sugar contents in the transgenic line 1, line 7 and line 8 were significantly higher than that of the control (21.70 mg?g-1FW), which were 2.87, 3.39 and 3.35 times of the control. There was a positive correlation between soluble solids contents and soluble sugar contents (=0.811*), but there was no significant difference in the soluble solids contents of the samples. The contents of amino acids in the fruiting fruits of the transgenic lines were ranging from 0.2580 to 0.3950 g/100 g FW. The content of amino acids in the control was 0.5151 g/100 g FW, which was significantly higher than that of the transgenic lines. The contents of titratable acid in the transgenic line 1 and line 7 were significantly higher than that in the control. The content of ascorbic acid in line 1 was 168.35 mg/100 g FW, which was significantly higher than that of the wild-type of 92.50 mg/100 g FW. The contents of soluble protein in transgenic line 9 and line 10 were 25.97 and 25.86 mg?g-1FW, respectively, which was significantly higher than that of control (22.93 mg?g-1FW). The expression levels of,(cinnamoyl-CoA reductase 2-like) and(myb-related protein 306) in the transgenic lines were significantly higher than that of the wild-type. It was found that the promoter region of differentially expressed genes contained a variety of higher plant cis-acting elements, mainly were CAAT-box and TATA-box, which had enhanced transcription efficiency of eukaryotes.It also included some the cis-acting elements such as G-Box, G-box, MBS, ARE, 5UTR Py-rich stretch, which can affect the response of each gene to light and play a regulatory role in the phenylpropane metabolic pathway.【】regulated the related genes involved in the development and maturation of transformants, improved the effectiveness of light, activated the key genes of flavonoid biosynthetic pathway. Differentially expressed genes contained a large quantity of light-induced response elements. The expression ofandpromoted the synthesis of secondary metabolites such as flavonoids, phenols, anthocyanins and total phenols. The transformation ofgene resulted in a significant increase in the nutrient and coloring material contents and improved the fruit quality in strawberry.

strawberry (Duch.);; overexpression; fruit quality; promotor

2017-08-31；

2017-11-14

江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX(12)5065）、江蘇省六大人才高峰人才項目（NY068）

閻依超，E-mail：2014104020@njau.edu.cn。萬春雁，E-mail：254071691@qq.com。閻依超與萬春雁為同等貢獻作者。

高志紅，Tel：025-84395724；E-mail：gaozhihong @njau.edu.cn