陳 毅， 夏磊磊， 張 揚， 高建萍， 李賽娜， 雷雄心， 李勇超， 張貴鋒， 趙 博

(1. 北京博輝瑞進生物科技有限公司， 北京 100026； 2. 中國科學院 過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室， 北京 100190； 3. 河南科技學院 生命科技學院，新鄉(xiāng)453003)

脫細胞小腸黏膜下層基質(zhì)(SIS，Small intestinal submucosa)是以豬小腸黏膜下層為原料，通過脫細胞、成型和滅菌等工藝制備而成的膜狀材料，廣泛用于肌腱、硬腦膜、腹壁和皮膚等組織的修復(fù)或重建，具有生物相容性高、生物可降解和可吸收等優(yōu)點[1-2]。臨床應(yīng)用結(jié)果表明SIS可有效誘導(dǎo)細胞黏附生長、術(shù)后并發(fā)癥少且感染率低[3-5]，證實了SIS是一種無免疫排斥的動物源性植入材料。

SIS作為一種脫細胞基質(zhì)，其主要成分為Ⅰ、Ⅲ型膠原和少量的其他類型膠原；同時還包含少量的纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、層黏連蛋白和生長因子等生物活性成分[6]。FN是一種以二硫鍵連接的二聚體(220 ku)形式存在的糖蛋白，可由成纖維細胞、肌細胞和內(nèi)皮細胞等多種細胞分泌。不同動物來源FN的分子量、三維結(jié)構(gòu)及生物學性能沒有顯著差異[7]。FN與多種細胞包括成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等表現(xiàn)出黏附和遷移特性，具有細胞外黏合劑的美稱[8]。FN在胚胎生成、傷口愈合和止血等過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，其表達和降解過程異常與許多疾病諸如心血管病和腫瘤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[9-10]，因此，脫細胞基質(zhì)中FN的含量直接影響SIS的生物活性。因此，研究并建立脫細胞基質(zhì)中FN的檢測方法具有重要實用價值。

文獻報道的FN檢測方法有多種[11-14]，其中最為常用的是ELISA法，該方法主要用于血漿型FN的檢測。SIS中的FN屬于組織型并以結(jié)合形式存在，直接采用ELISA方法則抗體難以直接與FN結(jié)合，非特異性吸附也會影響結(jié)果的準確度，導(dǎo)致檢測結(jié)果與實際含量存在較大偏差?；谫|(zhì)譜的蛋白質(zhì)檢測方法用于低豐度蛋白的定量分析具有靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，可根據(jù)蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物中的多肽豐度進行無標記定量檢測，但該方法直接用于SIS中FN的檢測則存在序列特異性酶難以直接降解等難度，導(dǎo)致這些方法存在一定局限性。

針對脫細胞基質(zhì)中FN檢測存在的問題，本研究擬建立一種基于酶解和質(zhì)譜分析的FN定量檢測方法，實現(xiàn)首先采用膠原酶將SIS進行降解，通過胰蛋白酶將FN進行定向酶解獲得FN特征多肽，再采用HPLC-MS進行含量檢測，并對該方法的線性范圍、精密度、穩(wěn)定性進行驗證。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

1.1.1材料

SIS(VIDASISTM)由北京博輝瑞進生物科技有限公司提供；SIS(Biodesign?)購自美國庫克公司；Ⅰ型膠原酶(分析純)購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶(序列純)購自美國Promega公司；Fibronectin購自美國CALBIOCHEM公司。

1.1.2主要儀器

HC-2518R高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；LGJ-100F真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(HPLC-MS)由美國Agilent公司1100液相色譜和美國Thermo Fisher公司LCQ DecaXP電噴霧質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件為Xcalibur 1.3；液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)由美國Thermo Fisher公司U3000液相和TSQ Quantum ACCESS MAX質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件為Xcalibur 1.3。

1.2　實驗方法

1.2.1SIS降解實驗

靜態(tài)酶解：稱取100 mg SIS，加入100 mL 緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.36 mmol/L CaCl2，pH 7.4)，100℃熱變性處理10 min，冷卻至室溫后加入1 mL膠原酶溶液(1 mg/mL HBSS緩沖液)，37℃水浴震蕩，10 000 r/min離心3 min，收集上清液。

分批次酶解：稱取100 mg SIS，加入8 mL 緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.36 mmol/L CaCl2，pH 7.4)，100℃熱變性處理10 min，冷卻至室溫后加入200 μL膠原酶溶液(1 mg/mL HBSS緩沖液), 37℃酶解1 h，10 000 r/min離心3 min，收集上清液，沉淀加入200 μL膠原酶溶液和8 mL緩沖液，重復(fù)上述操作5次，收集所有上清液。

1.2.2胰蛋白酶酶解實驗

將SIS的膠原酶降解產(chǎn)物冷凍干燥，使用50 mmol/L NH4HCO3溶液(pH 8.0)配置成4 mg/mL的溶液，加入20 μL濃度為1 μg/μL的Trypsin溶液(50 mmol/L NH4HCO3，pH 8.0)，37℃酶解12 h，酶解產(chǎn)物直接進行HPLC-MS檢測。

1.3　分析方法

1.3.1氨基酸組成分析

SIS及其酶解產(chǎn)物的氨基酸組成分析方法參照文獻[15]。

1.3.2HPLC-MS分析

色譜柱為Zorbax SB C18[150×2.1 mm(I.D.)，5 μm]；流動相A：水(含0.1%甲酸)，B：乙腈(含0.1%甲酸)；梯度0～80 min，5%～50%乙腈；80～90 min，50%～90%乙腈，進樣量50 μL；UV：214 nm；流速0.2 mL/min。離子阱質(zhì)譜條件：離子源噴霧電壓4.5 kV，毛細管溫度300℃，掃描范圍m/z 400～2000。精確質(zhì)量數(shù)掃描和二級質(zhì)譜掃描均為數(shù)據(jù)依賴型掃描，碰撞能量為35%。

三重四極桿質(zhì)譜條件：離子源噴霧電壓3.5 kV，毛細管溫度300℃，蒸發(fā)溫度：200℃，殼氣：35 arb，輔助氣：8 psi，掃描方式為選擇離子監(jiān)測，m/z 957.5。

2　結(jié)果與討論

2.1　SIS降解方法研究

FN與膠原具有較高的結(jié)合特性，在細胞外基質(zhì)中以與膠原結(jié)合的狀態(tài)存在[16]，傳統(tǒng)方法難以有效檢測出脫細胞基質(zhì)中的FN。為能使FN從結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x狀態(tài)并進一步被酶解，實驗首先研究了FN的釋放方法。圖1是不同酶解方式降解過程中SIS殘留量的動態(tài)變化曲線。采用靜態(tài)酶解法加入膠原酶后溶液中SIS殘留量逐漸降低，酶解24 h后降解率僅為60%，降解3 d后仍有10%的SIS未被降解，4 d后殘留量趨于穩(wěn)定，溶液中殘留不能被降解的絮狀物(圖1)。氨基酸分析結(jié)果表明，殘留物中幾乎不含有羥脯氨酸，表明SIS中的膠原成分被有效降解。但是采用該方法降解SIS的過程耗時長，且存在易染菌、酶失活以及隨機降解率高等問題。為了提高酶解效率，實驗嘗試了分批次降解的方式，即降解一定時間后進行固液分離，沉淀物重新酶解。SIS殘留量在前3次降解過程中變化較明顯，第1次換液時殘留量為70%，第2次換液時殘留量為50%，第3次換液時殘留量約為30%(圖1)，該過程重復(fù)5次后SIS酶解較為完全。為了最大程度減少樣品中蛋白損失，實驗在分批次降解過程中降解次數(shù)增加至6次。

2.2　基于質(zhì)譜的檢測方法

2.2.1FN特征多肽篩選

FN經(jīng)序列純胰蛋白酶處理后產(chǎn)生大量低分子量多肽；實驗對多肽進行了BLAST序列比對，只在豬源FN數(shù)據(jù)庫被檢出的肽段為豬源FN的特征多肽；酶解后的多肽質(zhì)譜信息用SEQUEST軟件進行數(shù)據(jù)庫搜索，多肽過濾參數(shù)為Xcorr>1.5(單電荷)，Xcorr>2.0(單電荷)，同時Deltacn>0.1，則所產(chǎn)生的肽段被認為是陽性結(jié)果。在HPLC-MS分析的質(zhì)譜圖中提取特征多肽的離子流圖，低濃度樣品可提取到且豐度較高，同時信噪比S/N>10，即適合作為特征多肽。

圖1靜態(tài)酶解和分批次酶解過程中SIS殘留量的動態(tài)變化

將胰蛋白酶酶解后的豬源FN用離子阱質(zhì)譜(LCQ)進行全掃描分析，得到豬源FN酶解多肽的總離子流圖(圖2)。采用BLAST多序列比對發(fā)現(xiàn)豬源FN存在一定數(shù)量的特征多肽，再用Bioworks軟件搜索豬源FN降解后的多肽質(zhì)譜信息，篩選具有陽性結(jié)果的多肽段，根據(jù)BLAST多序列比對和Bioworks軟件搜庫結(jié)果選定多肽SSPVVIDASTAIDAPSNLR為豬源FN的特征多肽，其豐度和二級碎片匹配度均較高。圖3和圖4分別為該多肽的提取離子流圖(含一級質(zhì)譜圖)和二級質(zhì)譜圖，二級碎片離子與理論值匹配度較高。因此，可選擇該多肽作為特征多肽，用于豬源FN類型識別及定量檢測。

圖 2 豬源FN酶解產(chǎn)物總離子流圖

圖 3 特征多肽的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖

2.2.2豬源FN濃度與特征多肽信號強度關(guān)系

取不同濃度經(jīng)變性酶解處理的豬源FN標準品溶液，從低濃度到高濃度依次進樣50 μL，按HPLC-MS定量檢測條件分析，監(jiān)測目標離子m/z=957.5，獲得不同濃度豬源FN特征多肽的提取離子流圖(圖5)，按照所選特征多肽提取離子流圖峰面積為縱坐標、豬源FN標準品濃度為橫坐標進行線性回歸(圖6)，回歸方程為y=4109.5x-12.82(R2=0.995)，在0.0024～0.048 g/L濃度范圍內(nèi)二者線性關(guān)系良好。

圖 4 特征多肽的二級質(zhì)譜圖

圖5 不同濃度的豬源FN特征多肽的提取離子流圖

A、B、C、D和E分別為0.0024、0.0048、0.0096、0.0192及0.048 mg/mL

圖 6 豬源FN標準品濃度與信號強度關(guān)系曲線

2.2.3SIS中FN含量檢測結(jié)果

稱取50 mg SIS(VIDASISTM)加入膠原酶分5次酶解，合并5次酶解的上清液，冷凍干燥，得到123 mg凍干物(含提取液里的鹽類物質(zhì))，取4 mg凍干后的產(chǎn)物復(fù)溶，利用胰蛋白酶酶解，酶解產(chǎn)物按照HPLC-MS定量檢測方法進行分析，根據(jù)FN特征多肽的提取離子流色譜峰面積計算，樣品溶液中FN的濃度為0.007 mg/mL，則SIS中FN的含量為0.43%。采用相同的測定方法，SIS(Biodesign?)中FN的含量測定結(jié)果為0.17%。

2.3　精密度與穩(wěn)定性驗證

2.3.1線性范圍

將同一樣品稀釋成不同的濃度，分別為2.4、4.8、9.6、19.2、48、96和192 μg/mL，通過HPLC-MS檢測其纖維連接蛋白含量，根據(jù)濃度梯度和峰面積關(guān)系，確定峰面積呈線性的濃度范圍(圖7)。實驗結(jié)果表明本方法的線性程度較高。

圖 7 FN質(zhì)譜檢測方法的線性范圍

2.3.2精密度

精確量取FN標準品100 μL，按定量HPLC-MS條件進行分析，重復(fù)進樣3次，結(jié)果(如圖8)顯示，F(xiàn)N標準品中特征多肽的峰面積相對偏差RSD為1.31%，表明本方法精密度良好。

圖 8 FN質(zhì)譜檢測方法的精密度分析

2.3.3穩(wěn)定性

將樣品分別于-20℃保存，于10、20和30 d時間用FULL SCAN測定3次樣品，其峰面積分別為3.82×108、3.45×108和3.16×108，保存30 d的樣品峰面積略微減小，表明該方法具有較高的穩(wěn)定性。

3　結(jié)論

FN作為細胞外基質(zhì)重要組成部分，具有諸多生物學活性功能。采用分批次酶解和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對SIS脫細胞基質(zhì)材料中FN含量進行了定量檢測。針對SIS的膠原酶酶解方案進行優(yōu)化，消除了時間長，效率低等弊端，將膠原酶酶解時間由96 h降為6 h，大大地提高了酶解效率。實驗中FN經(jīng)Trypsin特異性酶解所得的特征多肽為SSPVVIDASTAIDAPSNLR，采用HPLC-MS對FN中這一特征多肽定量檢測，準確地得到SIS中FN的含量。這種方法操作簡便，且適用于組織中FN的檢測。結(jié)果表明VIDASISTM和Biodesign?兩種脫細胞材料中FN的含量分別為0.43%和0.17%。方法學實驗證明該方法精確度較高，誤差較小，并且不同濃度積分出的峰面積線性關(guān)系良好。該研究表明，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可以準確測定脫細胞基質(zhì)中FN的含量。

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