朱中杰，黃 青

(1. 中國科學院 上海應用物理研究所，上海201800；2. 中國科學院 合肥物質科學研究院，合肥230026)

2004年，曼徹斯特大學的兩位科學家Novoselov和Geim[1]采用簡單機械分離的方法得到單層石墨烯，首次獲得SP2雜化軌道形成的單原子層碳結構材料，并且提出了這種二維材料具有的很強的雙極電場作用。這種新型材料石墨烯擁有比硅更高的載流子遷移率，而且電子在石墨烯的運動中會產(chǎn)生極少的熱量，有望替代硅材料來制作晶體管器件，給電子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來新的契機。此外，單層石墨烯納米材料還具有獨特的光學、電子和機械性能，如大比表面積、高電導率以及熱穩(wěn)定性等，在許多領域顯示了很好的應用前景。因此，2010年兩人由于石墨烯材料的重大發(fā)現(xiàn)而獲得諾貝爾物理學獎。

平面二維石墨烯材料呈現(xiàn)為單原子層蜂窩狀排列，是目前為止最薄的二維材料，僅為0.35 nm，非常穩(wěn)定，具有獨特的物理性能。此外，石墨烯的衍生物氧化石墨烯材料(graphene oxide 簡稱GO)由于含有含氧官能團，有非常好的水溶性、溶液分散性、生物相容性，且對特定的生物分子的高親和力。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)納米結構的石墨烯及其衍生物氧化石墨烯材料(統(tǒng)稱graphene materials，GMs)還有一定的細胞毒性和抗菌性能[2]，并且可以應用于藥物的傳遞、生物傳感器、以及癌癥治療等，其在生物醫(yī)學領域的發(fā)展也日益得到關注(圖1)[3]。為此，本文主要介紹石墨烯材料的有關制備方法、抗菌性能與機制、以及該材料與其他金屬或非金屬材料等形成復合材料在生物滅菌方面的研究及應用進展。

1　石墨烯及其衍生物氧化石墨烯的結構、性質與制備方法

石墨烯由二維單原子層組成，呈蜂窩狀排列的晶體結構(圖2)[4]。二維的石墨烯材料可以形成零維的球形富勒烯結構，也可以卷曲形成二維碳納米管結構，還可以層層疊放形成三維石墨體。石墨烯的衍生物氧化石墨烯(GO)含有豐富的官能團結構，具有較高的比表面積。一般情況下GO呈現(xiàn)親水性，在水中具有很好的分散性。

圖1 石墨烯及納米復合材料在生物醫(yī)學中的應用[3]

圖2 石墨烯與幾種碳材料[4]

石墨烯材料理化性質與它的結構和狀態(tài)(大小、形狀、層數(shù)、聚集程度和表面修飾等)有關，而其結構和狀態(tài)是由制備方法所決定的。石墨烯的制備方法有很多，但是根據(jù)制備方法的不同得到的產(chǎn)物的物理化學性質就有所不同。目前，根據(jù)實驗條件的不同，主要分為固相法、液相法、氣相法，常用的一些方法有機械剝離法、氧化還原法、化學氣相沉積法(CVD)和電化學法等。最簡單也是最早期的機械剝離的方法是由Geim等[4]人用的膠帶撕扯法，原因是因為石墨層之間是以范德華力結合，結合能約為2 eV/nm2，那么將石墨烯層剝離所需要的力為300 nN/μm，因此，普通膠帶可以將石墨烯層剝離。操作比較簡單，將膠帶在石墨上撕扯下來多層石墨，膠帶之間再反復撕扯，這樣的操作重復多次，最后將其轉移到襯底上，就可以得到單層石墨烯。目前應用最廣泛，也是早期就有相關研究報道的一類比較穩(wěn)定操作的方法，主要是選擇將石墨烯在強氧化劑作用下將石墨粉氧化成氧化石墨烯，再用還原劑將氧化石墨烯還原得到石墨烯。先將石墨氧化成氧化石墨烯的方法有很多，最經(jīng)典也是最常用的有3種，分別是：Hummers氧化法[5]、Brodie法[6]和Staudenmaier法[7]。3種氧化方法都是將強酸(如濃硫酸)小分子插入到石墨層之間，再通過強氧化劑(如高錳酸鉀、高氯酸鉀等)對其進行氧化。相比較于其他兩種方法來,Hummers氧化法安全性高，試驗中較多采用此方法。Hummers氧化法首先將石墨粉在冰水浴、強酸環(huán)境下反應，加入高錳酸鉀在調控適當?shù)臏囟认?，反應?shù)小時，最后再加入適量水以及雙氧水，用來還原溶液中未反應完全的強氧化劑。還原氧化石墨烯目前主要采用抗壞血酸或水合肼做還原劑。其中，抗壞血酸做還原劑，通過超聲剝離的方法將具有多氧官能團的氧化石墨烯剝離成單層的石墨烯。采用化學氣相沉積法可以制備大面積的具有優(yōu)異的電學和光學性能的石墨烯薄膜。該方法的原理是將碳氫氣體吸附于具有催化活性的非金屬或金屬表面，加熱后使碳氫氣體脫氫在襯底表面形成石墨烯。早期的Obraztsov等[8]采用CVD法制備石墨烯薄膜，采用鎳做襯底。除了鎳做襯底還可以選擇其他金屬做襯底如銅膜等[9]，該方法將碳高溫熔解進入鎳基體中，冷卻后析出，碳沉積的厚度和結晶度與冷卻速率和碳在高溫下熔解的溫度息息相關。CVD法制備的石墨烯表現(xiàn)出非常好的靈活性以及優(yōu)異的電學光學性能，而且大面積制備有利于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

除了上述幾種常用的制備石墨烯的方法之外，還有其他的方法，比如通過加熱碳化硅單晶表面，脫附硅原子制備石墨烯的外延生長法[10]、電化學方法[11]、溶劑剝離法、溶劑熱法及有機合成法。每一種方法的反應條件不同，優(yōu)缺點不同，制備出的石墨烯的物理、化學性質等不同，所以根據(jù)實驗要求選取相應的方法。表1是幾種典型的石墨烯制備方法的比較。

2　石墨烯及其衍生物氧化石墨烯的抗菌性研究

2010年，Huang和Fan等[12]首次將石墨烯材料應用于抑制大腸桿菌的研究；與此同時，Akhavan和Ghaderi[13]也發(fā)現(xiàn)和報道了石墨烯納米材料的抑細菌(包括革蘭氏陰性菌和陽性菌)效應并探討了相關機理。此后關于石墨烯應用于生物抗菌領域的研究報告也越來越多，成為一個新的研究熱點。Akhavan和Ghaderi[13]對石墨烯及其衍生物氧化石墨烯的滅菌效果進行了檢測，比較了它們對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌性，發(fā)現(xiàn)均有較好的抑菌效果。大量實驗證明了石墨烯的滅菌效果，深入探索石墨烯與細菌的相互作用機制成為共同的目標。另外，石墨烯材料在一定條件下還可以與其它金屬、金屬氧化物或非金屬結合形成復合材料，由此獲得更強的抗菌效果。關于石墨烯的抗菌機理，由于石墨烯材料本身受所具有的物理化學性質的影響，比如：形態(tài)、大小、厚度、表面結構等，使得其在滅菌方面的效果相差較大。表2總結了石墨烯材料本身對抗菌效果的影響因素。

表1 幾種典型的石墨烯制備方法的比較

表2 單純石墨烯材料的抗菌因素

對于石墨烯本身因素的抗菌機理，研究人員已經(jīng)提出來了幾種主要的機制，如：納米刀理論、氧化脅迫作用、包裹作用等[14-16]，其細胞作用的主要靶物質或分子是細胞中的DNA/RNA和蛋白質以及細胞膜上的磷脂分子。早在2010年，Akhavan和Ghaderi[13]提出石墨烯納米材料鋒利的邊緣會導致細胞膜的破壞以及細胞內RNA的缺失。此后，不斷有研究學者發(fā)現(xiàn)這一效應[17-18]。關于石墨烯對細胞膜的作用，Zou等[19]通過大量的實驗總結得到動態(tài)模擬石墨烯納米片穿過細胞膜的過程。在這個過程中，石墨烯納米材料起到了“納米刀”的作用，用其鋒利的邊緣穿過細胞膜，通過理論模擬提出了“插入模式”。在這個“插入模型”中，除了GMs的邊緣的鋒利程度對細胞膜有影響之外，邊緣密度對抗菌活性也非常重要。Pham等[14]將石墨烯不同的邊緣密度以及不同的角度用于實驗，發(fā)現(xiàn)盡管已經(jīng)被證明在90°時對細菌有最強的殺菌效率，但是在37°時對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有抑制性。除上述的滅菌機制之外，單原子層的石墨烯薄膜可以包裹住細菌的細胞膜，給細菌提供了一個單獨的空間，將其與周圍的環(huán)境隔開，得不到營養(yǎng)物質的補充以及自身排出的毒素無法與外界環(huán)境交換，最后導致細菌死亡，鑒于石墨烯獨特的薄膜結構，這種機理的解釋受到廣泛的認同(圖3)[16]。近幾年對石墨烯薄膜對抗菌作用的研究不僅僅局限于“餓死”細胞，一些研究學者發(fā)現(xiàn)GMs捕獲細菌并包裹住細胞膜后會在一定程度上誘導細菌的細胞膜發(fā)生擾動。Chen等[20]發(fā)現(xiàn)GO一旦與病原體接觸就會交織在一起。在SEM下觀察，盡管細胞膜的完整性沒有得到破壞，但是出現(xiàn)了膜的擾動，并且進一步說明了將細菌包裹后對細菌的作用，通過膜電位實驗發(fā)現(xiàn)膜去極化損傷了細胞膜的結構。需要指出的是，在實際實驗的影響因素中較難控制單一變化條件，因此對其滅菌機制還存在許多爭議。在目前已知的報道中，發(fā)現(xiàn)有不同的現(xiàn)象可以用同一種機制解釋，或者同一種現(xiàn)象又可以有不同的機理來解釋。

圖3 大腸桿菌的AFM振幅和3D圖像變化[15]

A～F顯示在石墨烯包裹細菌時的不同狀態(tài)

總之，目前所認識的抗菌作用就是抗菌物質與細菌本身的成分的相互作用，即：通過氫鍵、π-π堆積、靜電吸附等與細菌中的生物分子發(fā)生作用，破壞或影響組成細胞膜的磷脂雙分子層、蛋白質以及細胞內部的遺傳物質DNA/RNA等，在此過程中，會誘發(fā)GMs的納米刀效應、提取脂質、破壞蛋白質以及活性氧機制，最終導致細菌中生物分子損傷、細菌生長抑制、細胞膜破壞、細菌內部物質流出和細菌死亡。圖4是對GMs對細菌作用的示意圖，較形象地說明了目前關于石墨烯材料產(chǎn)生抗菌性的多種機制[21-22]。

圖4 GMs的抗菌活動的機制[21-22]

3　石墨烯的金屬納米復合材料的增強抗菌性研究

金屬作為抗菌劑，在很早期的生活中，我們就已經(jīng)有所了解，比如銀器或銅制品盛裝食物，目的就是防止細菌污染。金屬滅菌主要是通過損傷細菌體內的DNA和蛋白質等生物大分子，進一步破壞細胞結構，達到滅菌的目的[23]。金屬可以作為滅菌劑的主要原因可以解釋為金屬離子進入細菌的細胞內，抑制酶的活性，或者產(chǎn)生過氧化氫，進而殺死細菌[24]。利用金屬滅菌方法操作簡單、滅菌范圍廣、效率高，并且最重要的是沒有抗菌性，但是金屬元素長期存在于環(huán)境中，對環(huán)境造成污染，威脅人類健康，且滅菌效果存在不穩(wěn)定的因素，達不到長久理想的效果，所以需要尋找新的抗菌劑來消除或者是減輕這些隱患。新興材料石墨烯及其衍生物氧化物具有抗菌性，同時傳統(tǒng)材料金屬以及金屬化合物在生物抗菌方面起重要作用。 下面我們簡單介紹石墨烯材料與金屬及金屬氧化物復合滅菌效果的研究及其進展。

在早期的介紹金屬滅菌的文章中，比較典型和應用比較早的金屬元素是銀(Ag)的使用，經(jīng)過大量的實驗證明了銀離子對微生物有毒害作用，而且包括大腸桿菌在內的多種細菌存在抑制作用?，F(xiàn)在關于銀離子以及納米銀的抗菌性研究也日益得到關注。Kim等[25]通過納米銀對酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制比較，證明了Ag納米顆粒可以有效地抑制微生物的生長，并且在抗菌控制系統(tǒng)以及醫(yī)療器械得到應用。關于與石墨烯結合形成復合抗菌材料，主要是用化學還原硝酸銀進行納米銀與GO的復合。近年，Liu等[26]通過簡單和綠色環(huán)保的合成方法制備了納米銀/GO復合材料，證明了GO/納米銀的復合之后比單純的銀納米或是GO具有更好的滅菌活性。Marambio-Jones等[27]對銀納米材料的滅菌進行了總結也概述了前些年對銀納米材料的研究。GO作為石墨烯的衍生物與納米銀復合的生物抗菌效果，已有很多實驗證明了石墨烯與納米銀復合后是一種理想的抗菌試劑[28-30]。Bai等[31]分別比較了RGO、AgNPs以及Ag/RGO的滅菌效果，證明了Ag/RGO優(yōu)異的滅菌效果。為了減少銀離子的用量， Zhang等[32]提出新型Ag/Pt復合石墨烯納米材料，從表面上看，至少是減少了金屬銀的用量。比較GO 、Ag/rGO 、Pt/Ag/rGO在培養(yǎng)基菌落上的抑制圈，發(fā)現(xiàn)Pt/Ag/rGO抑制圈最大，相應地證明了其抗菌活性最好。除了金屬Ag與Pt之外，Ag可以說是百搭的滅菌劑摻雜物,Ag可以與其他的金屬以及金屬氧化物復合，在增強抗菌效果的基礎上減少銀離子的加入量[33-34]。

表3 大腸桿菌在納米銀/石墨烯復合物作用下的抑制

銀的滅菌效果很好，但是銀作為貴金屬，在使用方面經(jīng)濟耗費大，所以除了金屬銀，研究學者還發(fā)現(xiàn)了Cu、Zn、Co、Ni、V等金屬以及復合物的生物抗菌研究[35]。銅作為廉價的滅菌劑，在食物滅菌等領域受到關注。目前常用的做法是把金屬銅與其他物質摻雜，或是添加某種有機物改善原有基礎上的抗菌活性。如： Trapalis等[36]利用溶膠-凝膠法制備Cu-SiO2材料，證明溶膠-凝膠法制備的Cu-SiO2薄膜材料有較高的抗菌活性。Ouyang等[37]采用多聚賴氨酸改善石墨烯活性與銅納米粒子復合，得出較好的水溶性和較長久的抗菌性。 除此之外， Jalal等[38]研究發(fā)現(xiàn)金屬氧化物氧化鋅具有抗菌活性。Kavitha等[39]發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅與石墨烯復合材料表現(xiàn)出良好的滅菌活性，通過氧化鋅/石墨烯復合材料以及氧化鋅材料的滅菌效果的比較，發(fā)現(xiàn)氧化鋅/石墨烯復合材料的滅菌效果更好，滅菌效果更明顯。在這個過程中，石墨烯增強了與細菌的接觸面積，增加了鋅離子在溶液中的濃度。2014年，Li等[40]采取不同的金屬、非金屬以及金屬氧化物等與石墨烯材料復合，檢測它們的抗菌性，發(fā)現(xiàn)石墨烯與導體Cu以及與半導體Ge對大腸桿菌具有抑制性，但是石墨烯與絕緣體SiO2卻對細菌沒有影響。

關于石墨烯與金屬或金屬氧化物復合材料的增強滅菌效果的機理研究，也是目前研究熱點之一。普遍認為，石墨烯與其他材料復合可以誘導細胞產(chǎn)生氧化應激過程[41]，通過其中的氧化脅迫作用，干擾細菌的新陳代謝，導致細胞內功能紊亂，從而達到抑菌的目的。當細胞內積累過量的活性氧(ROS)，如H2O2、O2-、OH-、1O2等，就會導致細胞內功能紊亂(如：蛋白質失活、脂質過氧化、線粒體功能破壞、細胞膜解體等)，最終導致細菌滅活。至于ROS，其來源可以通過多種方式產(chǎn)生，其中一種方式是芬頓反應。很多研究學者將金屬如Fe2+、Cu+等金屬離子與GMs形成復合材料，參與抗菌活動中，這些離子與細胞內積累的大量過氧化氫(H2O2) 上的羥基直接作用，生成活性氧，即：芬頓反應[42]。

在芬頓反應中起主要氧化作用的是羥基(OH·)自由基。此外，ROS的產(chǎn)生也與石墨烯納米材料性質有關。人們發(fā)現(xiàn)，在石墨烯表面生成ROS，通過增加ROS的含量，可以增強滅菌效果，這為氧化脅迫機理提供了支持。Zhao等[43]通過實驗證實了石墨烯納米材料與其氧化活性有關，石墨烯可以通過氧化還原反應直接生成活性氧(ROS)而達到滅菌目的。同樣可以證實活性氧機理的實驗結論還有碳納米材料與分子氧的反應，吸附在石墨烯表面上的氧會形成超氧中間體(如O2·-，HO2·等)，隨后氧化細胞GSH將結合這些生成的超氧中間體釋放到環(huán)境中，更多的實驗從實驗和理論證實石墨烯增加了ROS的產(chǎn)生[44]。

除此之外，石墨烯復合材料還有其他可能增強滅菌效果的機制。例如，當石墨烯與金屬復合后，人們發(fā)現(xiàn)滅菌活性并不主要來自于活性氧，而是通過電子轉移的方式達到滅菌的要求。最初證明該機制的是Li等[40]，他們采取不同的金屬、非金屬以及金屬氧化物等與石墨烯材料復合，檢測它們的抗菌性。他們發(fā)現(xiàn)石墨烯與導體Cu以及與半導體Ge對大腸桿菌具有抑制性，但是石墨烯與絕緣體SiO2卻對細菌沒有影響。此外，Zubir等[45]通過GO與Fe3O4復合材料發(fā)生的芬頓反應得出石墨烯材料因其具有較大的面積，可以作為導電橋，電荷發(fā)生在較遠的氧化物質上，進一步增強了氧化脅迫作用。實際過程或更復雜的實驗說明，對于石墨烯復合材料增強抗菌活性，其原因很可能是綜合了多種因素同時起作用(包括通過ROS的氧化脅迫作用和不依賴ROS的電子轉移作用等)，所以具體問題需要區(qū)別對待和分析。

4　結論與展望

石墨烯的出現(xiàn)，不僅僅豐富了碳家族，而且還推動了現(xiàn)代科學技術的發(fā)展。石墨烯材料的基礎和應用研究正方興未艾。石墨烯及其復合材料在生物醫(yī)學領域也顯示了廣闊的應用前景?，F(xiàn)在抗生素的大量使用，導致了多種耐藥或耐多藥的微生物的出現(xiàn)，每年有超過200萬人感染耐抗生素細菌并導致大約2萬人死亡，所以研制高效抑菌劑迫在眉睫，而基于石墨烯及復合材料有可能發(fā)展獲得新的高效抑菌劑。另外，目前關于石墨烯及其復合材料的滅菌效果、機制還在進一步深入探索之中，其中有許多有趣的待解問題。最近，黃青等[46]提出低溫等離子體改性氧化石墨烯以提高其抑菌性能的方法，并在實驗中已得到證明，有望進一步推動這方面的應用和研究。本文主要綜述了目前關于石墨烯及納米復合材料在抗菌領域方面的研究及進展，通過文獻調研列舉和比較了關于石墨烯及其復合材料的滅菌機制的不同認識和觀點，希望能為今后石墨烯滅菌效率機制研究及拓展石墨烯材料在生物醫(yī)學方面應用提供一些有益的提示。

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