周 穎， 馬 珺， 黃康寧， 陳曉蘭， 傅建義， 徐正強(qiáng)

(上海動(dòng)物園， 上海 200335 )

由于種群數(shù)量的大幅減少，卷羽鵜鶘(Pelecanuscrispus) 已被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)列為漸危種(Vulnerable)和中國(guó)的二級(jí)重要保護(hù)動(dòng)物。20世紀(jì)50年代末，上海動(dòng)物園從內(nèi)蒙古烏糧蘇湖自然保護(hù)區(qū)引進(jìn)了十幾只鵜鶘，以卷羽鵜鶘為主。20世紀(jì)70年代報(bào)道卷羽鵜鶘首次成功繁殖[1]。目前，種群已發(fā)展至40余羽(不包括出讓至其他動(dòng)物園的個(gè)體)。該種群是一個(gè)隔離種群，缺乏與外界個(gè)體的交流，再加上近年來(lái)人工繁殖個(gè)體很難引入種群內(nèi)[2]，種群出現(xiàn)了繁殖力下降，后代存活率降低等[3]問(wèn)題。另一方面由于長(zhǎng)期以來(lái)缺乏譜系標(biāo)記和資料記錄，種群內(nèi)個(gè)體的遺傳背景并不清楚，很難對(duì)其進(jìn)行有效的種群管理。

隨著對(duì)瀕危動(dòng)物保護(hù)遺傳學(xué)研究的日益重視和加強(qiáng)，微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)已被用來(lái)揭示瀕危物種的進(jìn)化歷史、分析種群遺傳結(jié)構(gòu)、輔助種群調(diào)查、鑒定親緣關(guān)系[4-5]和近緣物種及雜交個(gè)體[6]等。目前，盡管對(duì)卷羽鵜鶘的遺傳學(xué)研究報(bào)道較少，但Machado等[7]對(duì)非洲南部白鵜鶘(P.onocrotalus)種群的微衛(wèi)星進(jìn)行篩選和分析，得到10個(gè)微衛(wèi)星座位，并在褐鵜鶘(P.occidentalis)、美洲鵜鶘(P.erythrorhynchos)和粉紅背鵜鶘(P.rufescens)中能夠較好地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)的條帶；Hickman等[8]篩選了美洲鵜鶘(P.erythrorhynchos)的9個(gè)微衛(wèi)星座位，分析了北美洲東西兩個(gè)種群的遺傳多態(tài)性和種群結(jié)構(gòu)，并用于制定種群保護(hù)計(jì)劃。其中在現(xiàn)存8種鵜鶘的進(jìn)化關(guān)系中，卷羽鵜鶘與粉紅背鵜鶘親緣關(guān)系很近，同為舊世界進(jìn)化一支[9]。鑒于微衛(wèi)星引物具有通用性的特點(diǎn)，本文從已報(bào)道的19個(gè)微衛(wèi)星座位中篩選出12個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性的座位用于分析上海動(dòng)物園卷羽鵜鶘小種群的遺傳多態(tài)性和種群結(jié)構(gòu)，以期為該種群的有效管理提供遺傳學(xué)依據(jù)，并為野生種群遺傳多樣性保護(hù)提供參考。

1　材料與方法

1.1 樣品的采集

本次研究共收集了2010—2012年卷羽鵜鶘亞成體的血液樣品，共計(jì)26份。用75%乙醇按4∶1處理血樣，采樣后快速置于-20℃冰箱保存。

1.2 基因組DNA的提取與擴(kuò)增

用柱式小量組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(華舜W6501)直接抽提。本實(shí)驗(yàn)從19個(gè)微衛(wèi)星座位中篩選出12個(gè)多態(tài)性較豐富的座位進(jìn)行分析：PeErH09-11、PeErH09-13、PeErH10-01、PeErH10-03、PeErH10-04、PeErH10-05[8]和PeOnH10-08、PeOnH10-09、PeOnH10-12、PeOnH10-13、PeOnH10-14和PeOnH10-15[7]。其引物序列詳見(jiàn)表1。所有PCR擴(kuò)增都在T3-Thermocycler DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)總體積為20 μL：1×PCR Buffer (10 mmol/L Tris-HCl， 50 mmol/L KCl，pH 8.3)，25.0 μg/mL BSA，1 μmol/L引物，200 μmol/L dNTPs，0.5 UTaq酶，約100 ng/μL DNA，其中MgCl2濃度參見(jiàn)表1。

所有擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，退火溫度復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。各引物的退火溫度見(jiàn)表1。

擴(kuò)增產(chǎn)物用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)果通過(guò)銀染法檢測(cè)[10]。等位基因的分子量大小通過(guò)100 bp Marker (TaKaRa)用ImageTool (IT)3.0軟件確定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

表1 12對(duì)微衛(wèi)星座位的引物序列和PCR擴(kuò)增條件

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

在26個(gè)樣品中成功擴(kuò)增出了上述12個(gè)微衛(wèi)星座位，多態(tài)性100%(表2)。每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)不等，變幅為3～9個(gè)，平均5.33個(gè)；有效等位基因數(shù)平均為3.17個(gè)，占58.33%；觀察雜合度的變化范圍為0～1，平均為0.36；期望雜合度最大為0.58，最小為0.20，平均為0.39；Nei’s(1973)基因多樣性指數(shù)H為0.32～0.8，平均為0.64；PIC為0.29～0.78，平均0.60(表2)。

2.2　聚類(lèi)分析

利用NTsys 2.10e軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建出個(gè)體間的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。結(jié)果(如圖1)顯示，在相似系數(shù)為0.77處，樹(shù)形圖分出11個(gè)聚類(lèi)，其中16個(gè)個(gè)體構(gòu)成一個(gè)大的聚類(lèi)，編號(hào)2和4的個(gè)體聚成一類(lèi)，其余8個(gè)個(gè)體后代分別聚類(lèi)。

3　討論與結(jié)論

3.1 遺傳多樣性分析

有效等位基因數(shù)，基因雜合度和多態(tài)信息含量是反映群體遺傳變異的常用測(cè)度。在保護(hù)遺傳學(xué)研究中，有時(shí)更強(qiáng)調(diào)等位基因數(shù)目對(duì)種群的影響，但有效基因數(shù)目容易受到樣本量的影響[16]。與等位基因數(shù)相比，其雜合度的估計(jì)不依賴于樣本的數(shù)量，因此可以較好地反應(yīng)種群的遺傳多樣性水平[17]。基因雜合度是度量群體遺傳變異的一個(gè)最適函數(shù)，Ott[18]將多態(tài)位點(diǎn)定義為雜合度至少為0.10的位點(diǎn)，而Takezaki和Nei[19]認(rèn)為用于測(cè)定遺傳差異的標(biāo)記在群體中的平均雜合度在0.3～0.8才有實(shí)際意義。表2中各微衛(wèi)星座位的雜合度均大于0.2，但有近一半的微衛(wèi)星座位的基因雜合度小于0.3，平均值為0.39。以上說(shuō)明該種群的基因雜合度值偏小，不具有較高的群體雜合度和豐富的遺傳多樣性，這與其實(shí)際的遺傳背景是極其吻合的。上海動(dòng)物園的卷羽鵜鶘種群作為一個(gè)封閉性的種群，由最初的建群個(gè)體發(fā)展到現(xiàn)在，種群內(nèi)基因的純合子增加，遺傳差異明顯減少。

表2 卷羽鵜鶘微衛(wèi)星數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

NA：等位基因數(shù) Number of alles;NE：有效等位基因數(shù) Number of effective alleles;H：基因多樣性指數(shù) Genetic diversity index;HO：觀察雜合度 Observed heterozygosity;HE：預(yù)期雜合度Expected heterozygosity;PIC：多態(tài)信息含量 Polymorphism information content

圖 1 鵜鶘26個(gè)個(gè)體之間相互關(guān)系的分支聚類(lèi)圖

多態(tài)信息含量(PIC) 是等位基因頻率和數(shù)目變化的函數(shù)，反映著基因變異程度的高低。當(dāng)PIC>0.5 時(shí)，該座位為高度多態(tài)性座位；0.25

3.2 種群遺傳管理

26個(gè)樣本的聚類(lèi)分析結(jié)果如圖1所示，在相似系數(shù)為0.77處，樹(shù)形圖分出11個(gè)聚類(lèi)。其中16個(gè)個(gè)體構(gòu)成一個(gè)大的聚類(lèi)，全為2對(duì)卷羽鵜鶘的后代，個(gè)體相似系數(shù)為0.79～0.95，這與觀察結(jié)果相符合。除編號(hào)為2和4的個(gè)體親緣系數(shù)較近(個(gè)體相似系數(shù)為0.84)，可能來(lái)自同一對(duì)父母外，其余8個(gè)體分別聚類(lèi)。這10羽后代個(gè)體可能在不同程度上混有白鵜鶘(P.onocrotalus)的基因。

卷羽鵜鶘種群(16個(gè)樣本)的遺傳多樣性較低。這2對(duì)卷羽鵜鶘的后代如編號(hào)9和10，編號(hào)1和17，編號(hào)11和12的個(gè)體相似系數(shù)高達(dá)0.948、0.9310和0.9310。編號(hào)9和10的遺傳距離最短，只有0.052，這表明該群體的遺傳多樣性很低。

上海動(dòng)物園的卷羽鵜鶘存在近親繁殖和雜交并存的現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)卷羽鵜鶘遺傳多樣性分析，從遺傳的角度掌握該種群的基本信息，便于對(duì)其進(jìn)行合理有效的遺傳管理。建議如下：1)根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果，重點(diǎn)在于建立2對(duì)純卷羽鵜鶘種鳥(niǎo)后代譜系，對(duì)其后代個(gè)體添加腳標(biāo)或芯片，進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)；2)對(duì)于種群的近親交配問(wèn)題要予以高度重視，可采取人為干預(yù)措施，以避免過(guò)高的近交程度，而利于群體內(nèi)雜合子的保留；3)可考慮引進(jìn)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的卷羽鵜鶘，以改善種群的遺傳結(jié)構(gòu)，增加種群的遺傳多樣性；4)繼續(xù)監(jiān)測(cè)和分析該卷羽鵜鶘種群的遺傳多樣性。鑒于聚丙烯酰胺凝膠電泳方法存在的不足，應(yīng)采用更先進(jìn)、有效的方法如測(cè)序，對(duì)種群內(nèi)個(gè)體進(jìn)行持續(xù)有效的遺傳管理。

致謝：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科學(xué)中心提供了分子研究實(shí)驗(yàn)條件，特此致謝。

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