王金革, 王連生, 王常安, 李晉南, 趙志剛, 羅 亮, 都 雪, 李偉忠, 徐奇友

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所， 哈爾濱 150070； 2. 上海海洋大 學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306； 3. 濰坊學(xué)院， 濰坊 261061)

芽孢桿菌(Bacillus)是活菌制劑，不利環(huán)境條件下可以孢子形式存在，具有耐高溫、耐擠壓和耐溫度變化等特點，可經(jīng)受配合飼料的制作條件，非常適合應(yīng)用于飼料的工業(yè)化生產(chǎn)，而且其代謝產(chǎn)物中含有許多消化酶類和多種抑菌活性物質(zhì)，使其逐漸成為營養(yǎng)學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科的研究熱點。沈文英等[1]對草魚(Ctenopharyngodonidellus)，Nayak等[2]對南亞黑鯪(Labeorohita)，劉克琳等[3]對鯉魚(Cyprinuscarpio)及胡毅等[4]對凡納濱對蝦的研究，Gatesoupe等[5]對大菱鲆(Scophthatmusmaximus)的研究及高欣等[6]、劉曉勇等[7]對鱘魚的研究表明，將芽孢桿菌添加到飼料中既能改善水產(chǎn)動物蛋白質(zhì)利用率，還能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抗氧化能力。20世紀(jì)中期，我國就有學(xué)者開始研究巨大芽孢桿菌的應(yīng)用，但以前的研究主要集中在菌株的篩選及氮的代謝能力等方面[8-9]，隨著對巨大芽孢桿菌更深入地了解，逐漸把其作為益生菌應(yīng)用到了水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中調(diào)節(jié)水質(zhì)[10-11]，但把其作為飼料添加劑的研究較少。前人研究表明，高植物蛋白質(zhì)的飼料會影響水產(chǎn)動物的抗氧化能力和生長性能[12]，而在飼料中添加適量芽孢桿菌可以提高養(yǎng)殖動物的抗氧化能力并促進(jìn)其健康生長[13]。因此本試驗擬通過在植物蛋白質(zhì)飼料基礎(chǔ)上添加不同水平的巨大芽孢桿菌，研究其對雜交鱘幼魚組織抗氧化能力和血清生化指標(biāo)的影響，并與魚粉蛋白源飼料組比較，為巨大芽孢桿菌在鱘魚植物蛋白源飼料養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

巨大芽孢桿菌制劑：由本實驗室從水產(chǎn)養(yǎng)殖底泥中分離獲得的巨大芽孢桿菌菌株，經(jīng)30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)后的菌液。使用前采用平板計數(shù)法獲得制劑中巨大芽孢桿菌數(shù)目。

1.2　試驗設(shè)計及飼料

挑選體格健壯、規(guī)格整齊的雜交鱘幼魚(購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚繁育技術(shù)工程中心)1500尾，暫養(yǎng)并馴化2周，暫養(yǎng)期間飼喂植物蛋白質(zhì)飼料，2周后選用初體質(zhì)量為(12.87 ± 0.65)g的雜交鱘幼魚625尾，隨機(jī)分成5組，每組設(shè)5個平行，試驗周期為56 d。以褐魚粉、豆粕、豆油和魚油等為主要原料配制魚粉蛋白源飼料(FM組)，以大豆?jié)饪s蛋白、豆粕、豆油和魚油等為主要原料配制植物蛋白質(zhì)飼料(PM組)，其配方的原料組成見表1；在植物蛋白質(zhì)飼料的基礎(chǔ)上，分別加入105(Ⅰ組)、106(Ⅱ組)、107cfu/g(Ⅲ組)巨大芽孢桿菌配制5種試驗用飼料。先將飼料原料粉碎過40目篩，按配方比例稱重后用混合機(jī)混合均勻，然后加入混合好的油脂再與原料充分混合，最后再與水或巨大芽孢桿菌與水的混合物充分混勻，用制粒機(jī)做成粒徑大小適宜的飼料，室溫風(fēng)干，裝袋后保存于-20℃冰箱中。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

注：1)微量元素預(yù)混料為每千克飼料提供Fe 25 mg,Zn 25 mg,Mn 15 mg,Cu 3 mg,I 0.6 mg,Se 0.4 mg,Co 0.1 mg；2)維生素預(yù)混料為每千克飼料提供:VD33 000 IU,VA 8 000 IU,VC 500 mg,VB230 mg,VE 60 mg,VK35 mg,VB615 mg,VB120.5 mg,煙酸nicotinic acid 175 mg,泛酸 pantothenic acid 50 mg,葉酸 folic acid 5 mg,D-生物素 D-biotin 2.5 mg； 3) 粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和總磷為實測值

1.3　飼養(yǎng)管理

在25只容積為160 L可控溫循環(huán)式水族箱內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)試驗，水溫控制為(21±0.5)℃，試驗期間每天7：00、12：00、17：00飽食投喂，及時吸取殘餌和糞便，每周換去水族箱內(nèi)2/3水并注入已曝氣的水，每隔2天檢測水質(zhì)，溶氧大于5 mg/L，pH 7.9～8.3，氨氮濃度不高于0.05 mg/L。自然光照，記錄每天雜交鱘幼魚攝食和死亡情況。

1.4　樣品采集和指標(biāo)測定

1.4.1樣品采集

將試驗魚饑餓24 h后采樣，每缸隨機(jī)取出3尾魚用丁香油麻醉完全后，在尾靜脈處采血，分離血清(3500 r/min，15 min)，分離后將血清樣品保存于-80℃冰箱中。將采血后的魚置于冰盤上解剖，分別取出肝臟和幽門盲囊與預(yù)冷過的0.86%氯化鈉溶液按1∶9的比例(質(zhì)量體積比)稀釋，勻漿，然后按不同檢測指標(biāo)所需條件及試劑盒要求的速度和時間進(jìn)行離心，離心后取組織上清液樣品保存在-20℃冰箱中待測。

1.4.2指標(biāo)測定

血清、肝臟和幽門盲囊中還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量、黃嘌呤氧化酶(XOD)、抗超氧陰離子自由基(ASAFR)、總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定；葡萄糖(Glu)、血磷(P)、總蛋白(TB)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性等血清生化指標(biāo)采用全自動生化分析儀(貝克曼ProCX4，德國)測定。

1.5　統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用Duncan氏法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗，差異顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2　結(jié)果

2.1　巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血清蛋白代謝指標(biāo)的影響

巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血清蛋白代謝指標(biāo)的影響見表2。結(jié)果表明：各試驗組TP和GLB含量顯著高于PM組(P<0.05)，試驗Ⅰ組UA含量顯著低于PM組(P<0.05)，且與FM組相比差異均不顯著(P>0.05)；各試驗組BUN含量顯著低于PM組和FM組(P<0.05)。

表2 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血清蛋白代謝指標(biāo)的影響

同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)；標(biāo)有相同或沒有小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

2.2　巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血磷、血糖和轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)的影響

巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血磷、血糖和轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)的影響見表3。結(jié)果表明：試驗Ⅱ組血糖含量和ALT活性顯著低于PM組(P<0.05)，試驗Ⅰ組和Ⅱ組AST活性顯著低于PM組(P<0.05)，且與FM組相比差異均不顯著(P>0.05)；各試驗組血磷含量與PM組無顯著差異性(P>0.05)，但有升高趨勢。

表3 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血磷、血糖和轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)的影響

2.3　巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血清抗氧化指標(biāo)的影響

巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血清抗氧化指標(biāo)的影響見表4，結(jié)果表明：試驗Ⅰ組、Ⅱ組血清GSH含量和ASAFR活性顯著高于PM組(P<0.05)，試驗Ⅱ組和Ⅲ組血清XOD活性顯著低于PM組(P<0.05)，且與FM組相比差異均不顯著(P>0.05)。

2.4　巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響見表5。結(jié)果表明：試驗Ⅰ組肝臟GSH含量和ASAFR活性顯著高于PM組(P<0.05)，試驗Ⅱ組和Ⅲ組肝臟XOD活性顯著低于PM組(P<0.05)，且與FM組相比差異均不顯著(P>0.05)。

表4 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.5　巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚幽門盲囊抗氧化指標(biāo)的影響

巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚幽門盲囊抗氧化指標(biāo)的影響見表6，結(jié)果表明：試驗Ⅰ組、Ⅱ組T-AOC活性和SOD活性顯著高于PM組(P<0.05)，且與FM組相比差異不顯著(P>0.05)；試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組GSH含量顯著高于PM組和FM組(P<0.05)；各試驗組MDA含量和ASAFR活性差異均不顯著(P>0.05)。

表5 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

表6 植物蛋白質(zhì)飼料中添加巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚幽門盲囊抗氧化指標(biāo)的影響

3　討論

3.1　巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血清生化指標(biāo)的影響

測定血清生化指標(biāo)可以反映動物機(jī)體新陳代謝的情況[14]。血清TP可以讓血管內(nèi)酸堿度和滲透壓保持在正常范圍內(nèi)，還可以保障動物機(jī)體內(nèi)的正常運(yùn)輸[15]。血清球蛋白會通過與外來的特異性抗原起免疫反應(yīng)而保護(hù)機(jī)體，因此動物的免疫水平可以通過血清球蛋白含量高低在一定程度上得到反映[16]。本試驗中各試驗組雜交鱘幼魚血清TP和GLB含量均顯著高于PM組。究其原因，芽孢桿菌代謝過程中能產(chǎn)生豐富的蛋白酶，從而促進(jìn)對營養(yǎng)物質(zhì)的消化，一定程度上為血清蛋白質(zhì)的合成提供了豐富的原料[17]，而且在其代謝過程中還可以產(chǎn)生如脂多糖等具有免疫原性的活性物質(zhì)，從而刺激機(jī)體提高血清球蛋白含量，血清球蛋白含量升高也可引起總蛋白含量上升[18]。Tagari等[19]研究表明，血清BUN含量降低和蛋白氮的體內(nèi)沉積增加密切相關(guān)，從而提高飼料中蛋白質(zhì)利用率，因此血清BUN可以反映動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝情況。本試驗中各試驗組雜交鱘幼魚血清BUN含量均顯著低于PM組和FM組，說明將巨大芽孢桿菌添加到飼料中可以改善雜交鱘幼魚體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝情況，一方面巨大芽孢桿菌自身分泌的蛋白酶促進(jìn)了蛋白質(zhì)的消化吸收，另一方面通過降低XOD活性，抑制UA的生成，提高機(jī)體蛋白質(zhì)利用率。ALT和AST是機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)氨基作用過程中非常重要的酶，機(jī)體代謝正常的情況下在血清中含量很低，但是當(dāng)肝臟受到破壞時，就會使血清中的ALT活性升高，AST活性也會隨之升高[20]。本試驗中試驗組的AST和ALT活性均低于PM組，表明巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚肝臟無損傷，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[21-22]。本試驗中，試驗組的血磷含量有升高的趨勢，可能由于巨大芽孢桿菌代謝過程中產(chǎn)生了植酸酶，促進(jìn)了植酸磷水解[23]；試驗組血糖含量低于PM組，在正常生理范圍內(nèi)，同一條件下血糖含量低，表明其組織細(xì)胞的代謝加強(qiáng)[24]。

3.2　巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚組織抗氧化能力的影響

4　結(jié)論

雜交鱘幼魚植物蛋白質(zhì)飼料中添加一定量的巨大芽孢桿菌能夠提高組織抗氧化能力并改善血清生化指標(biāo)，適宜添加量為105～106cfu/g。

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