張 慧， 張世鑫， 吳紹華， 田維敏， 彭小列， 劉世彪

(1. 吉首大學(xué) 武陵山獼猴桃研究中心， 吉首 416000; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所 農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 儋州 571737)

獼猴桃(Actinidia)為獼猴桃科獼猴桃屬的多年生木質(zhì)藤本植物，其漿果營養(yǎng)豐富并具有藥用價值。自20世紀(jì)初以來，通過對野生資源的人工選擇馴化，獼猴桃已成為大規(guī)模商業(yè)化栽培最為成功的果樹之一。中國是獼猴桃屬植物起源、進(jìn)化及分布的中心，中國原產(chǎn)的獼猴桃有62種(全世界66種)，豐富的遺傳資源是研究獼猴桃屬植物演化、系統(tǒng)發(fā)育和分類的基礎(chǔ)，也為獼猴桃品種選育和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了豐富的原材料[1-2]。由于獼猴桃屬植物的種間雜交現(xiàn)象明顯，尤其是不同變種間的雜交產(chǎn)生出的一系列過渡類型，以及復(fù)雜的染色體倍性，使得某些種間及變種間的分類界定不清楚，僅憑果實(shí)外觀形態(tài)、生理特征來進(jìn)行遺傳多樣性評價，有時難度較大。分子生物學(xué)手段可有效地運(yùn)用于植物的遺傳多樣性和遺傳差異分析，在獼猴桃的品種親緣關(guān)系和性別鑒定方面已有應(yīng)用[3-6]。其中擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP) 是一種基于PCR和限制性內(nèi)切酶酶切的DNA分子標(biāo)記技術(shù)[7]，結(jié)合了RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，且不受環(huán)境條件的限制，具有反應(yīng)靈敏、快速高效、指紋多態(tài)性豐富、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。AFLP 標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于柑桔[8]、蘋果[9]等果樹的資源評價和遺傳多樣性分析，在獼猴桃方面也有報道[10-13]。

表1 獼猴桃屬33份種質(zhì)信息和AFLP分析結(jié)果

*為優(yōu)良株系；其余為栽培品種或植物新品種

武陵山區(qū)是中國重要的獼猴桃自然分布區(qū)和果品生產(chǎn)區(qū)，其中的湘西土家族苗族自治州地處武陵山腹地，野生獼猴桃資源豐富，已選育了6個優(yōu)良的獼猴桃品種和植物新品種(米良1號，湘吉，湘吉紅，米良2號，湘碧玉，貝木)以及優(yōu)良株系野生(吉首)獼猴桃，還引種栽培了數(shù)個國內(nèi)優(yōu)良品種，而有關(guān)該地區(qū)獼猴桃類群分布與遺傳多樣性的研究還未見報道。本研究利用AFLP標(biāo)記技術(shù)對采自湖南湘西、貴州貴陽、四川都江堰和海南海口的33份獼猴桃種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳差異分析，以進(jìn)一步了解其親緣關(guān)系，并為獼猴桃遺傳資源的保存和優(yōu)良品種的篩選提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　植物材料

2014年9月于湖南湘西的吉首、溆浦，四川都江堰龍門山，貴州貴陽，海南?？诓杉?3份獼猴桃種質(zhì)資源，分屬于4個物種：中華獼猴桃(Actinidiachinensis)18份，美味獼猴桃(A.deliciosa)13份，對萼獼猴桃(A.valvata)1份，闊葉獼猴桃(A.latifolia)1份，具體信息如表1所示。

1.2　樣品處理和基因組DNA制備

每株取枝蔓頂部10 cm幼莖及初展的2～3片幼葉，每3株的材料做混合樣，硅膠干燥保存?zhèn)溆?。? g混合樣品于研砵中加液氮磨成粉末，使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit [寶生物(大連)工程有限公司]提取和純化樣品的基因組DNA，以Thermo Gene Company Limited ND2000(Thermo Fisher Scientific, Inc., USA)測定DNA的含量，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

1.3　AFLP 引物對篩選和AFLP 分析

根據(jù)EcoR I和MseI酶切和接頭序列，各設(shè)計篩選擴(kuò)增引物8條(表2)，并從64對引物中隨機(jī)匹配23對引物進(jìn)行AFLP實(shí)驗(yàn)(表3)。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行合成。AFLP分析參照Vos等[7]和秦小波等[14]方法進(jìn)行，相關(guān)酶切反應(yīng)及檢測試劑和儀器購自New England Biolabs (Beijing) LTD.、Bio-Rad Laboratories, Inc.(USA)以及寶生物(大連)工程有限公司。

1.4　數(shù)據(jù)分析

用數(shù)字1和0，分別表示實(shí)驗(yàn)獼猴桃材料的某一等位變異的“有”和“無”，“有”帶的值為1，“無”帶的值為0。利用NTSYS-pc2.1[15]軟件計算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，每兩個種質(zhì)之間的遺傳距離GD=1-2Nij/(Ni+Nj)，其中Ni和Nj分別為樣品i和j具有帶的條數(shù)，Nij為兩樣品共有帶的條數(shù)。根據(jù)所得遺傳距離，利用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(unweighed pair group method arithmetic average, UPGMA)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　DNA純化和AFLP 擴(kuò)增

從圖1可見，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit提取和純化得到材料的DNA濃度和質(zhì)量均較好(圖1-A)，使用Thermo Gene company Limited ND2000測定其含量，且A260/A280值范圍為1.94～2.06，證明所得 DNA 樣品的質(zhì)量較好，可以用于AFLP分析獼猴桃種質(zhì)的遺傳差異性。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增的條帶彌散且清晰，條帶大小約為100～1500 bp(圖1-B)，可以用于變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。選用23對AFLP選擇性引物對33份獼猴桃屬植物的材料進(jìn)行AFLP分析，均得到清晰的指紋(圖1-C)，且各引物組合的指紋圖譜反映出所有種質(zhì)均表現(xiàn)出多態(tài)性，說明AFLP技術(shù)在獼猴桃種質(zhì)鑒定中是可行的。

圖1 獼猴桃DNA 和AFLP 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig 1 DNA and polyacrylamide gel electrophoresis of AFLP selective amplification for kiwifruits

A：部分獼猴桃品種的DNA；B：部分PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；C：EcoR I-3/MseI-1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物

表2 AFLP所用接頭和引物序列

2.2　獼猴桃屬33份種質(zhì)的遺傳多樣性

表1為33份獼猴桃種質(zhì)資源的產(chǎn)地及AFLP的分析結(jié)果，它顯示各種質(zhì)的擴(kuò)增條帶分布均勻。在23對引物所獲得的622個多態(tài)性位點(diǎn)中，最多的米良2號的多態(tài)性帶數(shù)為349條，多態(tài)性比例達(dá)56.1%，顯示其雜合程度高；最少的是野生獼猴桃(吉首)，多態(tài)性帶僅有214條，多態(tài)性比例34.4%。同時，對萼獼猴桃的多態(tài)性帶條偏少(249條)，多態(tài)性比例40.03%，而闊葉獼猴桃的多態(tài)性帶為318條，多態(tài)性比例51.13%，處于中等水平。

表3為23對AFLP引物序列及擴(kuò)增條帶信息。23對引物共獲得了683個遺傳位點(diǎn)，即33份種質(zhì)共獲得683條擴(kuò)增譜帶，平均每對引物的遺傳位點(diǎn)為29.7個，其中多態(tài)性位點(diǎn)共622個，多態(tài)性比例平均為91.07%，對33個種質(zhì)材料的區(qū)分率達(dá)到100%。上述數(shù)據(jù)表明獼猴桃屬植物在分子水平上存在豐富的遺傳多樣性，每對引物的多態(tài)性位點(diǎn)都較豐富，最高的多態(tài)性比例高達(dá)100%，最低的有50.0%，平均條帶/種質(zhì)16.1，說明上述方法完全可以區(qū)分這些種質(zhì)。

表3 AFLP引物組合及擴(kuò)增條帶

2.3 獼猴桃屬33份種質(zhì)的遺傳距離和聚類分析

根據(jù)UPGMA軟件對33份獼猴桃種質(zhì)遺傳距離的分析，各獼猴桃種質(zhì)間均存在一定的遺傳距離，其值在0.05與0.83之間，平均為0.2325，遺傳距離越小，親緣關(guān)系越近，反之越遠(yuǎn)。如有些品種間的遺傳距離很小，例如1號(湘吉紅)與2號(紅陽)的遺傳距離最小僅為0.05，5號(貝木)與6號(翠玉)的遺傳距離為0.07，它們的相似性很高，說明在進(jìn)化過程中由于自然選擇，其生物性狀和遺傳物質(zhì)趨于一致。與其他種質(zhì)遺傳距離較大的有10號金豐(中華獼猴桃)，平均值為0.31，9號野生美味獼猴桃(平均0.367)，12號闊葉獼猴桃(平均值0.37)，闊葉獼猴桃與吉首野生美味獼猴桃的遺傳距離為0.48，顯示了較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。而遺傳距離最大的是14號水楊桃(平均值0.70)，它與吉首野生獼猴桃之間的遺傳距離系數(shù)達(dá)0.83，說明兩個物種間的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，這與各自的花、果實(shí)和葉等植物學(xué)性狀的差異是相符合的。

利用UPGMA對23對引物組合檢測出的683個遺傳位點(diǎn)相關(guān)性進(jìn)行聚類，如圖2所示。33份供試獼猴桃屬種質(zhì)之間相似系數(shù)為0.51～0.95，顯示獼猴桃種質(zhì)間的遺傳關(guān)系存在一定距離。在相似系數(shù)0.70的水平，可以將供試的33個材料分為3個類群，Ⅰ類：包括所有的中華獼猴桃和美味獼猴桃物種；Ⅱ類：闊葉獼猴桃；Ⅲ類：水楊桃(對萼獼猴桃)。闊葉獼猴桃與中華獼猴桃和美味獼猴桃的相似系數(shù)較小，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而水楊桃(對萼獼猴桃)與前兩者的相似系數(shù)最小，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。在最大的第I類分支中，共包括31份樣品，在0.82水平上又可以將其主要再分為Ⅳ類、Ⅴ類和其他細(xì)支，Ⅳ類包括湘吉紅、紅陽、米良1號、米良2號、湘碧玉、廬山香、貝木、翠玉和湘吉，Ⅴ類包括早鮮、金艷、川獼1號、武植3號、金桃、海沃德、布魯諾、徐香、華美2號、魁蜜、黃金果、金農(nóng)、楚紅、貴長、華美1號、豐悅、貴豐和金魁。與Ⅳ、Ⅴ類遺傳距離較遠(yuǎn)的分支有太上皇、綠珠、野生(吉首)和金豐。

3　討論

AFLP標(biāo)記的對象是雙酶切處理的基因組DNA，獲得的指紋圖譜多態(tài)性豐富。該技術(shù)因其高效而穩(wěn)定，重復(fù)性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用在作物資源評價和遺傳多樣性分析。本研究用23對引物共獲得了33份獼猴桃種質(zhì)資源的683個遺傳位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)622個，多態(tài)性比例平均為91.07%，區(qū)分率達(dá)100%。證明AFLP標(biāo)記擴(kuò)增效率高，是分析獼猴桃品種遺傳差異的一種有效的手段。

這些獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.51～0.95之間，說明獼猴桃種質(zhì)的多樣性水平較高。圖2表明，4個種33份獼猴桃種質(zhì)資源基本上按照種分別聚在一起，尤其是闊葉獼猴桃和對萼獼猴桃(水楊桃)按組系關(guān)系聚類現(xiàn)象明顯，與徐小彪[11]的研究結(jié)果相似，顯示出華南四省獼猴桃的遺傳多樣性差異較大。種質(zhì)的親緣關(guān)系在一定程度上與地理分布有關(guān)。例如，6個湖南吉首地區(qū)選育的品種中，米良1號和米良2號的相似系數(shù)為0.89，湘碧玉與之關(guān)系較近，黃肉品種貝木和無籽獼猴桃品種湘吉距離較遠(yuǎn)，而紅肉型的湘吉紅品種距離最遠(yuǎn)，但所有這些種質(zhì)都聚在Ⅳ類中，相似系數(shù)達(dá)到了0.8(圖2)，反映了在相同的環(huán)境中長期的進(jìn)化選擇使其親緣關(guān)系更近。又如海沃德、華美2號、貴長、華美1號、貴豐、金魁等幾個品種被歸為一類，這批材料均采自貴陽，其相似系數(shù)達(dá)0.83，而采自湖南溆浦縣的金艷、金桃、徐香、黃金果和楚紅都聚于V類的上半部分，相似系數(shù)0.86，顯示出很近的親緣關(guān)系，證明獼猴桃具有按照地理來源聚類的趨勢[16]。通常同一物種不同品種間的親緣關(guān)系較近，如中華獼猴桃的紅陽與湘吉紅，貝木和翠玉，美味獼猴桃的米良1號和米良2號，貴長和華美1號。但中華獼猴桃和美味獼猴桃之間具有較高的基因流、存在共祖多態(tài)和遺傳漸滲現(xiàn)象等，兩者存在著密切的親緣關(guān)系和聚類交叉關(guān)系[17-20]，這種現(xiàn)象在陳華等[21]對江西31份獼猴桃種質(zhì)和秦小波等[14]對西南地區(qū)10種獼猴桃50個樣本的遺傳多樣性研究中得到支持，本文中的金艷與川獼1號，魁蜜與華美2號，湘碧玉和廬山香，金豐與野生美味獼猴桃等也是如此，這也與我國獼猴桃育種實(shí)踐中常采用親緣關(guān)系較近的親本雜交有關(guān)，從而使育成品種之間的遺傳距離逐漸下降。尤其是吉首野生的美味獼猴桃，單果較大，果形圓柱形，與原產(chǎn)于湘西鳳凰縣的米良1號和米良2號差別很大，現(xiàn)證明其間的遺傳差異也很大，該優(yōu)株有進(jìn)一步研發(fā)的前景，也可以作為一個新的雜交種質(zhì)資源。

圖2 基于AFLP 標(biāo)記的獼猴桃屬33份種質(zhì)遺傳距離的UPGMA 聚類分析Fig 2 UPGMA dendrogramof 33 kiwifruit germplasms based on AFLPs

采自海南?？诘拈熑~獼猴桃(斑果組)和采自湖南吉首的水楊桃(對萼獼猴桃，凈果組)，均為單獨(dú)的物種，他們彼此間及與中華獼猴桃和美味獼猴桃(同屬星毛組)品種間的相似系數(shù)小，遺傳距離大，親緣關(guān)系也最遠(yuǎn)，符合傳統(tǒng)的形態(tài)分類結(jié)論。從獼猴桃親緣關(guān)系聚類圖上可以看出各種質(zhì)的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近及其在分類上的系統(tǒng)地位。因此，傳統(tǒng)的形態(tài)分類結(jié)合分子標(biāo)記，從分子水平上反映獼猴桃屬種質(zhì)之間的親緣關(guān)系，可以作為獼猴桃種質(zhì)分類及選育種的評價依據(jù)。

致謝:特別感謝為本研究提供實(shí)驗(yàn)材料的四川龍門山獼猴桃基因庫、貴陽市烏當(dāng)區(qū)開元獼猴桃研究所、海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、湖南永鑫特色農(nóng)業(yè)開發(fā)專業(yè)合作社。

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