李　婷, 李　璐, 王姝越, 戴曉峰, 白仲虎

(1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室， 無錫 214122； 2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 無錫 214122； 3. 上?？萍即髮W(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 上海 201012)

乳腺癌是我國婦女中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高居榜首[1]。近幾年，隨著早期診斷技術(shù)以及治療方式的發(fā)展，乳腺癌致死率已顯著降低。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，至少包含5種截然不同的亞型，即腔A型(luminal A)、腔B型(luminal B)、HER2型、基底型(basal)和正常細(xì)胞樣型(normal-like)[2]。目前，臨床上針對luminal型和HER2型乳腺癌均已經(jīng)有了較好的治療方式，如激素受體陽性的luminal型常采用內(nèi)分泌療法并輔以他莫昔芬靶向治療，該類乳腺癌患者預(yù)后較好；HER2型乳腺癌患者雖預(yù)后較差，但該類型患者對化療及赫賽汀(Herceptin)靶向治療均具有良好的反應(yīng)；而基底型乳腺癌患者由于低表達雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及人類表皮生長因子受體2(HER2)，致使其對內(nèi)分泌治療及靶向治療藥物均不敏感，該類型患者惡性程度極高，常伴隨復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，5年存活率不到15%[3-4]。因此，針對基底型乳腺癌進行研究，找出其特定有效的靶標(biāo)將對該類病人起到至關(guān)重要的作用。

腫瘤干細(xì)胞理論的提出為探索基底型乳腺癌的治療方式帶來了曙光。該理論認(rèn)為乳腺癌中存在乳腺癌干細(xì)胞亞群，可自我再生并驅(qū)動腫瘤發(fā)生，是產(chǎn)生治療抗性及復(fù)發(fā)的根源[5]。基底型乳腺癌許多特性與癌癥干細(xì)胞十分相似[6-7]，許多研究表明針對腫瘤干細(xì)胞設(shè)計靶向創(chuàng)新型藥物可能是治療基底型乳腺癌的有效方法[8]。乳腺癌干細(xì)胞的識別方法中表面標(biāo)志物CD44高表達CD24低表達(CD44+CD24-/low)分離法是最早被發(fā)現(xiàn)可以用來分選乳腺癌干細(xì)胞的方法，CD44+CD24-/low干細(xì)胞與惡性程度高度相關(guān)，轉(zhuǎn)移部位乳腺癌表達CD44+CD24-/low干細(xì)胞比例顯著高于原發(fā)灶[9]，且該亞群細(xì)胞具有間充質(zhì)特性，與腫瘤的轉(zhuǎn)移及化療、放療抗性密切相關(guān)[10]。因此對CD44+CD24-/low干細(xì)胞亞群進行深入研究，尤其是從整體轉(zhuǎn)錄水平研究其特征基因，將更加深入地了解該干細(xì)胞亞群的分子機制，找到干細(xì)胞相關(guān)靶點基因，為基底型乳腺癌患者提供靶向治療的新策略，從而從根本上解決基底型腫瘤易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的難題。

本研究從乳腺癌干細(xì)胞方向出發(fā)，將流式分選的基底型乳腺癌細(xì)胞系HCC1937和SUM149PT的干細(xì)胞及非干細(xì)胞作為模型，通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)篩選出干細(xì)胞和非干細(xì)胞的差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)，并對DEGs進行生物信息學(xué)分析，為進一步探索基底型乳腺癌的靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　主要試劑和儀器

RPMI 1640(Hyclone)，Ham′s F-12、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購于Gibco公司；D-PBS、HEPES(吉諾生物)，胰島素(Insulin)購于無錫市第四人民醫(yī)院；氫化可的松(Hydrocortinsone)購于TOCRIS；RNA提取試劑盒(TIANGEN)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qRT-PCR試劑盒(TaKaRa)，引物設(shè)計由蘇州金唯智測序合成；PE標(biāo)記的鼠抗人CD24抗體、APC標(biāo)記的鼠抗人CD44抗體(BD)，流式緩沖液(D-PBS+1%FBS)，流式細(xì)胞分選儀BD FACSAria II(BD)，qRT-PCR儀(Applied Biosystem)。

1.2　細(xì)胞培養(yǎng)及乳腺癌干細(xì)胞分選

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞系SUM149PT來源于Asterand，HCC1937來源于ATCC (American Type Tissue Culture Collection)，SUM149PT細(xì)胞系用含有5% FBS、10 mmol/L HEPES、5 μg/mL Insulin和1 μg/mL Hydrocortinsone的Ham′s F-12培養(yǎng)基，HCC1937用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2乳腺癌干細(xì)胞分選及純度鑒定

收集對數(shù)期細(xì)胞，D-PBS洗滌1次，用流式緩沖液重懸細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至107個/mL。設(shè)置陰性對照組、實驗組，對照組加入100 μL細(xì)胞懸液，實驗組加入500 μL細(xì)胞懸液以及CD24-PE、CD44-APC各100 μL，混勻后室溫避光孵育，每隔10 min混勻細(xì)胞1次，孵育20 min后流式緩沖液洗滌細(xì)胞1次，加入流式緩沖液重懸，流式細(xì)胞儀上機分選，得到各細(xì)胞系的CD44+CD24-/low干細(xì)胞亞群及non-CD44+CD24-/low非干細(xì)胞亞群，每個細(xì)胞系分選3次，分選后的細(xì)胞再次用流式細(xì)胞儀檢測各亞群細(xì)胞純度，保證各亞群細(xì)胞純度都在95%以上，純度合格后離心收集分選后的細(xì)胞，Trizol重懸，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃保存用于RNA-Seq。

1.3　轉(zhuǎn)錄組測序

RNA-Seq由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司所做，簡要步驟如下：分別提取分選的HCC1937、SUM149PT干細(xì)胞與非干細(xì)胞總RNA，使用DNase消化DNA后富集mRNA，用打斷試劑將mRNA打斷成短片段并以此為模板合成cDNA，使用試劑盒純化雙鏈cDNA再進行末端修復(fù)、加A尾，連接接頭后選擇合適的片段大小進行PCR擴增，構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeqTM 2500測序儀進行測序，上樣量為50 ng。

1.4　測序質(zhì)量評估

測序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)使用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)進行質(zhì)量評估，并通過軟件NGS QC Toolkit v2.3.3(http://59.163.192.90:8080/ngsqctoolkit/)對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控(QC)，過濾得到Clean reads，用tophat/bowtie2將clean reads與所選的參考序列(GRCh38)進行比對。統(tǒng)計reads在參考序列上的分布情況及覆蓋度，判斷比對結(jié)果是否通過第2次質(zhì)控。

1.5　差異表達基因的篩選

比對結(jié)果通過QC后，對基因進行表達分析，基因表達量使用FPKM(Fragments Per kb per Million reads)方法計算，公式如下(以基因A為例)[11]：

以校正的P值(false discovery rate, FDR)≤0.05、差異倍數(shù)的對數(shù)絕對值(︱log2FoldChange︱，︱FC︱)≥1為閾值，篩選干細(xì)胞和非干細(xì)胞的DEGs。

1.6　差異表達基因的GO分析和KEGG富集

篩選出DEGs后，我們對DEGs進行GO和KEGG富集分析，并用超幾何分布檢驗(hypergeometric test)方法計算每個GO條目和每個通路中DEGs富集的顯著性，P≤0.05認(rèn)為DEGs顯著富集。

1.7　差異表達基因的qRT-PCR驗證

提取對數(shù)期細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取1 μg cDNA為模板進行PCR(方法參照文獻[3])檢測目的基因的相對表達量。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計算基因表達豐度。各基因qRT-PCR引物序列如下：GAPDH引物(上游：5′-CCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游：5′-ATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′)，TGFBR2引物(上游：5′-AGGGCAAGTGCGTAAATGGAG-3′，下游：5′-TGGGCAGATTTCACGGCTG-3′)，IL6引物(上游：5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′，下游：5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′)和MMP2引物(上游：5′-TACAGGATCATTGGCTACACACC-3′，下游：5′-GGTCACATCGCTCCAGACT-3′)。

2　結(jié)果與分析

2.1　乳腺癌細(xì)胞系干細(xì)胞的分選與純度鑒定

為了在全轉(zhuǎn)錄水平探索干細(xì)胞的分子機理，挖掘其關(guān)鍵DEGs，我們根據(jù)此前文獻報道，選取干細(xì)胞比例在50%左右的基底型乳腺癌細(xì)胞系SUM149PT和HCC1937進行流式分選[12]，分別收集各細(xì)胞系的CD44+CD24-/low干細(xì)胞和non-CD44+CD24-/low非干細(xì)胞亞群(圖1-A、B)，每個細(xì)胞系分選3次。將分選的細(xì)胞進行二次流式檢測分選的細(xì)胞亞群純度，結(jié)果表明分選的HCC1937、SUM149PT干細(xì)胞亞群與非干細(xì)胞亞群純度都在95%以上(圖1-C、D、E和F)，滿足下一步試驗需求。

圖1 流式分選乳腺癌細(xì)胞系的干細(xì)胞與非干細(xì)胞亞群

A： SUM149PT細(xì)胞系的分選，紅色框線內(nèi)為干細(xì)胞亞群，藍色框線內(nèi)為非干細(xì)胞亞群； B： HCC1937細(xì)胞的分選； C： 分選后的SUM149PT干細(xì)胞純度檢測； D： 分選后SUM149PT非干細(xì)胞純度檢測； E： 分選后HCC1937干細(xì)胞純度檢測； F： 分選后的HCC1937非干細(xì)胞純度檢測

2.2　測序質(zhì)量評估

2.2.1測序數(shù)據(jù)預(yù)處理

分選的HCC1937以及SUM149PT干細(xì)胞和非干細(xì)胞分別提取總RNA，對各個細(xì)胞亞群進行RNA-Seq，每組3個重復(fù)。測序后得到SUM149PT干細(xì)胞、SUM149PT非干細(xì)胞、HCC1937干細(xì)胞、HCC1937非干細(xì)胞的原始片段(Raw reads)分別為63 736 099、63 966 929、63 364 586和64 750 000條，Raw reads經(jīng)質(zhì)控過濾得到的Clean reads分別為62 485 489、62 680 296、61 810 252和63 261 312條，分別占總Reads的98.04%、97.99%、97.55%和97.70%，其中過濾后的Q30比率分別為95.76%、95.80%、95.47%和95.58%(表1)，表明測序質(zhì)量較好可以用于下一步分析。

2.2.2參考序列比對分析

質(zhì)控后的Clean reads與參考序列(GRCh38)進行比對，結(jié)果表明(如表2)，能定位到基因組上的測序序列數(shù)量(Total mapped reads)占總reads數(shù)的88%以上，唯一比對到基因組序列(Uniquely mapped reads)占總reads的80%以上，這表明過濾的數(shù)據(jù)不存在污染并且選取的參考基因組合適。

2.2.3測序隨機性評估及reads覆蓋度分析

將reads在基因上的位置標(biāo)準(zhǔn)化到相對位置，通過統(tǒng)計基因的不同位置比對上的reads數(shù)來檢測RNA-Seq測序過程中mRNA序列打斷的隨機性。結(jié)果如圖2，不同樣本的reads在基因5′端到3′端分布相對均勻，打斷隨機性好。此外，我們計算了基因覆蓋度(每個基因被reads覆蓋的百分比)，結(jié)果表明覆蓋度在90%～100%的基因(枚紅色)占70%以上(圖3)。

表1 不同樣本過濾得到的測序產(chǎn)量

1，2，3: 各細(xì)胞系干細(xì)胞和非干細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)錄組測序的3個重復(fù)；P2：干細(xì)胞亞群；P3：非干細(xì)胞亞群。下同

表2 不同樣本的比對分析

2.3　差異表達基因的篩選

在去除FPKM<0.5的低表達基因后，我們以FDR≤0.05、︱FC︱≥1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選HCC1937干細(xì)胞和非干細(xì)胞、SUM149PT干細(xì)胞和非干細(xì)胞的DEGs，結(jié)果如圖4-A，HCC1937中干細(xì)胞和非干細(xì)胞的DEGs有413個(165個基因在干細(xì)胞中上調(diào)，248個基因下調(diào))，SUM149PT中干細(xì)胞和非干細(xì)胞的DEGs有832個(135個基因在干細(xì)胞中上調(diào)，697個基因下調(diào))。通過VENNY分析，我們得到HCC1937和SUM149PT細(xì)胞系中共有的上調(diào)DEGs 39個(圖4-B)，︱FC︱在1.0～3.5倍，下調(diào)DEGs 95個(圖4-C)，︱FC︱在1.0～7.4倍。

圖2 不同樣品的測序隨機性分布Fig 2 Randomness assessment of the samples

A-C：SUM149PT干細(xì)胞測序隨機性評估；D-F：SUM149PT非干細(xì)胞測序隨機性分布；G-I：HCC1937干細(xì)胞測序隨機性分布；J-L：HCC1937非干細(xì)胞測序隨機性分布。每行代表樣品的3個重復(fù)

2.4　差異表達基因GO功能分析

我們將篩選得到的134個DEGs進行GO功能富集分析，得到的1841個GO功能注釋中有1415個為生物過程(76.86%，biological processes, BP)，其中富集顯著的BP有血管生成、細(xì)胞遷移和間葉細(xì)胞增殖的正調(diào)控等，這說明干細(xì)胞DEGs很可能主要是通過調(diào)節(jié)生物學(xué)過程來促進自身的自我更新及較強的轉(zhuǎn)移侵襲特性；此外富集到細(xì)胞組分(cellular_component，CC)的GO條目占8.33%，最顯著富集的有胞外區(qū)、細(xì)胞外間隙、頂端質(zhì)膜和黏附功能等；分子功能(molecular functions， MF)的GO條目占15.26%，主要表現(xiàn)在細(xì)胞因子活性、細(xì)胞黏附分子結(jié)合和鈣離子結(jié)合等(表3)。

2.5　差異表達基因通路富集分析

在大多數(shù)生物學(xué)過程中基因常通過相互作用參與其中，為了進一步探索這些干細(xì)胞中的DEGs生物學(xué)功能，我們通過KEGG數(shù)據(jù)庫去研究DEGs主要參與的信號通路。134個DEGs共得到77條顯著富集的信號通路(P≤0.05)，DEGs顯著富集的通路包括腫瘤相關(guān)通路、蛋白多糖與腫瘤通路、PI3K-Akt信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞多能性通路和黏著斑通路等(圖5)。其中最富集的通路以及富集基因最多的通路都是腫瘤相關(guān)通路，14個富集到該通路中的DEGs中，有8個基因上調(diào)。

圖3 不同樣品的基因覆蓋度Fig 3 Gene coverage distribution in different cell subset

A-C：SUM149PT干細(xì)胞亞群的基因覆蓋度；D-F：SUM149PT非干細(xì)胞亞群的基因覆蓋度；G-I：HCC1937干細(xì)胞亞群的基因覆蓋度；J-L：HCC1937非干細(xì)胞亞群的基因覆蓋度。每行代表樣品的3個重復(fù)

圖4 干細(xì)胞和非干細(xì)胞的DEGs

A： HCC1937和SUM149PT細(xì)胞系中干細(xì)胞和非干細(xì)胞的DEGs，Venny分析共有的DEGs； B: 共有的DEGs在干細(xì)胞中上調(diào)的數(shù)目； C： 共有的DEGs在干細(xì)胞中下調(diào)的數(shù)目

圖5 DEGs富集最顯著的10條KEGG通路

2.6　差異表達基因的qRT-PCR驗證

為驗證轉(zhuǎn)錄組測序篩選的DEGs準(zhǔn)確性，我們隨機選取了3個DEGs，采用qRT-PCR檢測了它們在乳腺癌細(xì)胞系SUM149PT和HCC1937干細(xì)胞和非干細(xì)胞間的mRNA表達水平差異。結(jié)果(如圖6)表明，qRT-PCR檢測的TGRBR2、IL6和MMP2 3個DEGs的變化趨勢和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。

圖6 qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果

A： SUM149PT干細(xì)胞和非干細(xì)胞的DEGs驗證； B： HCC1937干細(xì)胞和非干細(xì)胞的DEGs驗證

表3 DEGs在各個生物學(xué)過程中富集最顯著的10個GO條目(A. 生物學(xué)過程，B. 細(xì)胞組分，C. 分子功能)

3　討論與結(jié)論

基底型乳腺癌多發(fā)于年輕和絕經(jīng)前女性，腫瘤狀態(tài)常為晚期，該類患者對內(nèi)分泌療法不敏感，且尚無較好的靶向治療策略[4]。隨著腫瘤干細(xì)胞研究的深入，越來越多的證據(jù)表明針對此類亞群細(xì)胞進行研究找出其潛在靶點可能是治療基底型乳腺癌的新曙光。RNA-Seq的發(fā)展為我們?nèi)嫔钊氲匮芯磕[瘤干細(xì)胞的分子機制帶來了希望。在本研究中，我們采用干細(xì)胞標(biāo)志物CD44+CD24-/low流式分選了基底型乳腺癌細(xì)胞系的干細(xì)胞和非干細(xì)胞亞群，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析了轉(zhuǎn)錄水平上干細(xì)胞和非干細(xì)胞之間DEGs，用以全面深入地探索乳腺癌干細(xì)胞的基因調(diào)控機制。

腫瘤干細(xì)胞是指存在于腫瘤當(dāng)中未分化的一部分亞群，多處于休眠狀態(tài)，具有自我更新及多向分化潛能，是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及抗藥性的根源所在[5]。在眾多的乳腺癌干細(xì)胞分離方法中，我們發(fā)現(xiàn)采用CD44+CD24-/low標(biāo)志物進行分選的方法研究最為廣泛，AL-Hajj等首次發(fā)現(xiàn)該方法可以分離乳腺癌干細(xì)胞，這一亞群細(xì)胞只需200個便可在免疫缺陷型小鼠中成瘤[13]，且該亞群細(xì)胞具有基底樣型特征，可提高腫瘤的侵襲能力并帶來化療抗性[10]。因此從CD44+CD24-/low亞群出發(fā)，靶向殺傷這一亞群細(xì)胞可能是治療基底型乳腺癌最有效的治療手段。在對轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在HCC1937和SUM149PT兩個細(xì)胞系共有的DEGs中，與上皮-間充質(zhì)(EMT)過程相關(guān)的IL6、MMP2和FOXC2在干細(xì)胞中顯著高表達。IL6是白介素家族的重要一員，有報道稱IL6可促使乳腺細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)(EMT)轉(zhuǎn)化，促使腫瘤產(chǎn)生藥物抗性[14]；MMP2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，它通過酶解作用激活TGF-β促使EMT進而促使腫瘤轉(zhuǎn)移[15]；差異最顯著的基因FOXC2在EMT過程中被激活[16]，也有報道稱shRNA敲除FOXC2后可顯著降低乳腺癌的轉(zhuǎn)移[17]。而我們的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中IL6、MMP2和FOXC2在干細(xì)胞中均顯著高表達，這表明這些基因很可能是干細(xì)胞的關(guān)鍵靶點，可以用來指導(dǎo)腫瘤的靶向治療。我們在這些DEGs中還發(fā)現(xiàn)，GATA3，F(xiàn)OXA1和ESR1轉(zhuǎn)錄因子在干細(xì)胞中顯著下調(diào)，這些基因都曾被報道過是管腔型乳腺癌的重要分型轉(zhuǎn)錄因子[18]。結(jié)合這些報道，可以發(fā)現(xiàn)從干細(xì)胞入手挖掘到的基因不僅可以用來指導(dǎo)靶向治療，還可以用來幫助識別乳腺癌亞型分類。

為了進一步研究DEGs所涉及的生物學(xué)功能及參與的關(guān)鍵信號通路，我們對134個DEGs進行了GO功能和KEGG通路富集。在GO分析中，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)DEGs都富集在腫瘤惡性程度密切相關(guān)的GO條目中，如血管生成、細(xì)胞遷移、增殖的正調(diào)控，細(xì)胞黏附分子結(jié)合等。在KEGG富集通路中，值得關(guān)注的是最富集的通路與通路中富集DEGs最多地出現(xiàn)了重疊，即腫瘤相關(guān)通路，該通路富集的14個DEGs中有8個基因(AXIN2、F2R、FGFR1、IL6、LAMC3、PRKCA、MMP2、TGFBR2)在干細(xì)胞中顯著上調(diào)。在最富集的前10條通路中也發(fā)現(xiàn)了PI3K-Akt信號通路，該通路被報道在腫瘤干細(xì)胞中起著重要作用，AKT的激活會促使乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲[8]。

本研究從乳腺癌干細(xì)胞入手，通過RNA-Seq初步探索了干細(xì)胞和非干細(xì)胞DEGs以及這些基因所富集的關(guān)鍵GO條目和KEGG信號通路，為深入研究乳腺癌干細(xì)胞的分子機制以及靶向治療基底型乳腺癌提供了理論基礎(chǔ)，接下來仍需對關(guān)鍵的干細(xì)胞DEGs開展更進一步的研究。

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