施　翎　聶振禹　馮微微　崔　寧　呂　敏　陳其軍　

(寧波市泌尿腎病醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江　寧波　315100)

血液透析是終末期腎病治療的主要手段，但血液透析患者發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險升高，探討預(yù)測慢性腎衰竭患者發(fā)生心血管事件的風(fēng)險因素有重要意義〔1〕。同型半胱氨酸(Hcy)水平升高是心血管疾病，尤其是冠心病的高危因子〔2〕。正常情況下血漿中有少量Hcy，大部分Hcy可在細(xì)胞內(nèi)分解，僅有少部分釋放至血漿中，而腎臟可清除70%血漿中的Hcy〔3〕。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是Hcy代謝的關(guān)鍵酶，對于維持Hcy正常代謝有重要作用〔4〕。MTHFR的基因多態(tài)性分布情況可影響其對Hcy的代謝〔5,6〕，故本研究篩選了3個標(biāo)簽(C677T、A1298C和G1793A)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，觀察其對血液透析患者血漿Hcy水平的影響。

1　資料與方法

1.1研究對象收集2013年1月至2016年12月于寧波市泌尿腎病醫(yī)院接受血液透析治療的88例慢性腎衰竭患者(疾病組)，均為漢族，其中男47例，女41例，年齡30～72歲，中位年齡61.5歲，<60歲37例，≥60歲51例；原發(fā)?。郝阅I小球腎炎24例，糖尿病腎病19 例，多囊腎15例，腎小動脈硬化12例，慢性腎盂腎炎9例，腎腫瘤7例，不明原因的腎萎縮2例?；颊呔邮苊恐?次的血液透析，每次4 h，血流量和透析液流量分別為250 ml/min和500 ml/min。選取同期92名健康體檢者作對比(對照組)，均為漢族，其中男50名，女42名，年齡29～73歲，中位年齡62.0歲，<60歲39例，≥60歲53例。兩組年齡及性別比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2樣本收集及處理88例慢性腎衰竭患者均于透析日晨透前空腹收集靜脈血5 ml，92例健康體檢者于體檢當(dāng)日收集空腹靜脈血5 ml，將外周血樣本置于含EDTA的抗凝真空采血管中，4 000 r/min離心10 min后，取上清分裝成兩份，其中一份用于檢測MTHFR的基因分型，另一份用于檢測血漿Hcy水平。

1.3SNPs位點篩選及基因分型采用Haploview 軟件從國際人類基因組單體型圖計劃(URL:http://www.hapmap.org/index.html.en)篩選出MTHFR基因3個標(biāo)簽SNPs〔C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)和G1793A (rs4846049)〕，要求最小等位基因頻率 MAF>0.05和連鎖不平衡參數(shù)r2>0.8。采用寶生物公司的DNA提取試劑盒提取基因組DNA，選取純度、完整度及無降解的DNA標(biāo)本采用Applied Biosystems進行擴增。蘇州金唯智公司設(shè)計并合成PCR擴增及延伸引物，采用直接測序法進行基因分型。

1.4血漿Hcy水平檢測取制備好的血漿標(biāo)本，室溫復(fù)溫后采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒檢測以上標(biāo)本中的血漿Hcy水平，以上操作均嚴(yán)格遵循試劑盒說明書。

1.5評價指標(biāo)(1)比較疾病組和對照組C677T、A1298C和G1793A基因型和等位基因的分布差異；(2)比較疾病組MTHFR基因SNPs位點各基因型的血漿Hcy水平；(3)以疾病組血漿Hcy水平的均數(shù)為界值分為正常(≤均數(shù))和升高(>均數(shù))，以比值比(OR)及其95%置信區(qū)間(CI)評價以上SNPs發(fā)生Hcy升高的風(fēng)險情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS19.0軟件。SNP基因型及等位基因型分布比較采用χ2檢驗，計算調(diào)整后的OR及95%CI。

2　結(jié)　果

2.1兩組MTHFR基因SNPs位點的分布情況疾病組與對照組A1298C基因型和等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組C677T和G1793A基因型和等位基因分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中疾病組C677T TT基因型和T等位基因的比例及G1793A AA基因型和A等位基因的比例明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1　兩組MTHFR基因SNP位點的分布情況(n)

2.2兩組的血漿Hcy水平比較疾病組血漿Hcy水平〔(38.25±4.67)μmol/L〕顯著高于對照組〔(19.36±2.59)μmol/L，P<0.05〕；以疾病組血漿Hcy水平的均數(shù)為界值將88例患者分為正常(≤19.36 μmol/L)36例和升高(>19.36 μmol/L)52例。

2.3疾病組MTHFR基因SNPs位點基因型與血漿Hcy水平的關(guān)系疾病組MTHFR基因A1298C位點各基因型血漿Hcy水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；MTHFR C677T、G1793A各基因型血漿Hcy水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C677T TT型的血漿Hcy水平高于CC、CT型，CT型的血漿Hcy水平高于CC型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；G1793A AA型的血漿Hcy水平高于GG、GA型，GA型的血漿Hcy水平高于GG型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　疾病組MTHFR基因SNP位點基因型與血漿Hcy水平的關(guān)系

2.4MTHFR基因SNPs位點基因型與血漿Hcy水平的關(guān)系

2.4.1C677T以CC基因型為參照， TT基因型血漿Hcy水平升高的風(fēng)險升高至3.429倍(P<0.05)，而CT、CT+TT型血漿Hcy水平升高的風(fēng)險未改變(P>0.05)；以C等位基因為參照，攜帶T等位基因者Hcy水平升高的風(fēng)險升高至2.050倍(P<0.05)。見表3。

2.4.2A1298C以AA基因型為參照，AC、CC及AC+CC基因型血漿Hcy水平升高的風(fēng)險未改變(P>0.05)；以A等位基因為參照，攜帶C等位基因者Hcy水平升高的風(fēng)險未改變(P>0.05)。見表3。

2.4.3G1793A以GG基因型為參照，GA、AA及GA+AA基因型血漿Hcy水平升高的風(fēng)險未改變(P>0.05)；以G等位基因為參照，攜帶A等位基因者Hcy水平升高的風(fēng)險未改變(P>0.05)。見表3。

表3　MTHFR基因SNP位點與血清Hcy水平升高的關(guān)系(n)

3　討　論

MTHFR在人體葉酸的吸收過程中發(fā)揮了重要作用，當(dāng)該酶發(fā)生突變時其活性受影響，不僅影響葉酸代謝，而且會導(dǎo)致體內(nèi)Hcy水平升高，增加了心血管事件和血栓的發(fā)生風(fēng)險〔7〕。目前報告較多的 MTHFR多態(tài)性位點包括C677T(rs1801133)和A1298C(rs1801131)，可直接導(dǎo)致MTHFR活性降低〔8，9〕。Hcy在體內(nèi)是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，對于蛋氨酸循環(huán)有重要作用，當(dāng)遺傳代謝障礙或機體發(fā)生營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時，均可導(dǎo)致Hcy在體內(nèi)蓄積〔10〕。盡管維持性血液透析是終末期腎病的主要替代療法，但血液透析對大分子毒素的清除能力較弱〔11〕，而如Hcy等大分子毒素可引起心血管病變等遠期并發(fā)癥，嚴(yán)重影響慢性腎衰竭患者的生活質(zhì)量〔12〕。

本研究采用直接測序法檢測88例接受血液透析的慢性腎衰竭患者的3個標(biāo)簽MTHFR SNPs〔C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)和G1793A (rs4846049)〕分布情況，結(jié)果提示C677T和G1793A這兩個SNPs位點可能參與慢性腎衰竭的發(fā)生發(fā)展過程。本研究也提示慢性腎衰竭患者接受血液透析過程中出現(xiàn)了Hcy蓄積，MTHFR 677T、G1793A多態(tài)性與血透患者的血漿Hcy水平有關(guān)，可能與攜帶突變基因者的MTHFR活性降低有關(guān)。

進一步分層分析發(fā)現(xiàn)，MTHFR 3個SNP位點中僅C677T與血透患者的血漿Hcy異常升高有關(guān)，更加強調(diào)MTHFR基因多態(tài)性在慢性腎衰竭患者血液透析過程中Hcy升高中的作用，但具體機制尚不清楚，是否與基因突變導(dǎo)致的MTHFR活性降低有直接關(guān)系，還需進一步研究。

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