錢金花　景　璇　魏美美　毛宇湘　

(河北省中醫(yī)院脾胃病科，河北　石家莊　050011)

1河北省中醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科

肝癌患者大多確診時已處于中晚期，因此手術(shù)及介入治療成為肝癌治療最為常見的治療手段，但是化療使患者產(chǎn)生耐藥及較強(qiáng)毒副作用〔1〕。目前中醫(yī)認(rèn)為肝癌主要發(fā)病機(jī)制為正虛邪陷，即脾氣污虛，肝氣郁滯，因此應(yīng)當(dāng)以健脾扶正，消癥散結(jié)為原則進(jìn)行治療〔2,3〕。健脾消癥方是我科在總結(jié)前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗，自制的針對肝癌治療的中藥復(fù)方，且曾有研究顯示以健脾消癥論治肝癌能顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株(H22)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖〔4〕，但具體機(jī)制報道較少。磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路是一種與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)的信號途徑，被稱為“抗凋亡途徑”，在肝癌等多種腫瘤中被高度激活，成為多種抗癌藥物的作用靶點〔5〕。本研究旨在探討健脾消癥方對H22肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

1　材料與方法

1.1一般資料細(xì)胞株為小鼠肝癌細(xì)胞株H22細(xì)胞主要試劑與儀器：兔抗人細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1，CyclinE，p21，p27，PI3K，AKT，p-AKT及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體均購自美國Abcam公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒，細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自南京凱基生物技術(shù)有限公司。DYCZ-25D型雙垂直電泳儀，DYCZ-25D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；MK3酶標(biāo)儀購自美國thermo公司。

1.2藥物制備健脾消癥方由河北省中醫(yī)院脾胃病二科自制。生藥與蒸餾水以1∶10的比例，85℃加熱回流提取，每次1 h，共3次，再水浴濃縮，制備成相當(dāng)于生藥材2 mg/ml的水提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3MTT法檢測H22細(xì)胞活力將5×103個H22細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，0(對照組)，0.5，1.0，2.0 mg/L的健脾消癥方處理細(xì)胞24、48、72 h，加入20 μl的MTT孵育4 h，翻轉(zhuǎn)96孔板并棄去上清液，再加入150 μl二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物溶解，在酶標(biāo)儀波長560 nm處測OD值，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(健脾消癥方OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡將8×103個H22細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，0(對照組)，0.5，1.0，2.0 mg/L的健脾消癥方處理細(xì)胞48 h，每組收集1×105/ml個細(xì)胞，再加入500 μl結(jié)合緩沖液并混勻后，按順序加入5 μl的Annexin V-FITC及5 μl的PI，繼續(xù)吹打混勻，在室溫下避光孵育10 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期將8×103個H22細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，0(對照組)，0.5，1.0，2.0 mg/L的健脾消癥方處理細(xì)胞48 h，每組首先收集1×105/ml個細(xì)胞，再加入5 μl Rnase混勻后，37℃孵育1 h，再加入PI染液混勻，于室溫避光孵育30 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測分析。

1.6Western印跡檢測細(xì)胞中CyclinD1，CyclinE，p21，p27及PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)將8×103個H22細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，0(對照組)，0.5，1.0，2.0的健脾消癥方處理細(xì)胞48 h，將細(xì)胞刮下并裂解，離心獲得的上清液即是總蛋白，接著測定蛋白濃度。制作蛋白濃縮膠及分離膠，蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人CyclinD1，CyclinE，p21，p27，PI3K，AKT，p-AKT及GAPDH多克隆抗體，稀釋度為1∶100)4℃過夜孵育；第2天二抗溶液室溫孵育1 h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1健脾消癥方對H22細(xì)胞活力的影響隨著作用時間延長，細(xì)胞增殖抑制率顯著提高(P<0.01)，同時隨著健脾消癥方濃度升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著提高(P<0.01)。且在48 h細(xì)胞活力適于后續(xù)實驗研究，因此選擇48 h作為后續(xù)實驗時間。見表1。

與對照組比較：1)P<0.01；下表同

2.2健脾消癥方對H22細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響與對照組比較，0.5、1.0、2.0 mg/ml組健脾消癥方能顯著提高細(xì)胞早期及晚期凋亡率，且使細(xì)胞周期阻滯在G1期(均P<0.01)。見表2。

表2　健脾消癥方對H22細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

2.3健脾消癥方對H22細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，0.5，1.0，2.0 mg/ml組健脾消癥方能顯著下調(diào)CyclinD1及CyclinE表達(dá)，上調(diào)p21及p27表達(dá)(均P<0.01)。見表3，圖1。

2.4健脾消癥方對H22細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，0.5，1.0，2.0 mg/ml組健脾消癥方能顯著下調(diào)PI3K及p-AKT表達(dá)(P<0.01)。見表4，圖2。

圖1　健脾消癥方對H22細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

組別CyclinD1CyclinEp21p27對照組096±009098±010019±001023±00205ng/ml組084±0081)048±0041)031±0031)024±0021)1．0ng/ml組047±0051)032±0031)049±0041)042±0041)2．0ng/ml組033±0031)032±0031)099±0101)091±0091)

圖2　健脾消癥方對H22細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

組別PI3K/GAPDHp?AKT/AKT對照組087±008101±01005ng/ml組048±0051)095±0091)1．0ng/ml組022±0021)045±0041)2．0ng/ml組020±0021)034±0031)

3　討　論

中醫(yī)認(rèn)為肝癌病機(jī)為脾胃兩虛，濕熱血淤，因此應(yīng)當(dāng)以健脾扶正，消癥散結(jié)為原則進(jìn)行對癥治療〔2〕。我科自制脾消癥方，其中黃芪，白術(shù)，白芍及薏苡仁等配方成分具有益氣扶正之功效，赤芍、當(dāng)歸、鱉甲、三七粉、夏枯草等配方成分具有活血化瘀消癥，解毒涼血之功效，被用于臨床肝癌的治療，同時還發(fā)現(xiàn)以健脾消癥法論治肝癌有顯著的抑制肝癌H22細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用〔4〕。本研究首先參考相關(guān)文獻(xiàn)〔4〕，表明健脾消癥方能顯著提高細(xì)胞增殖抑制率，在2 mg/ml的濃度作用48 h細(xì)胞活力降低將近一半，適于后續(xù)實驗研究，因此選擇48 h作為后續(xù)實驗時間。接著本研究繼續(xù)利用Annexin V-FITC/PI流式雙染法檢測健脾消癥方對H22細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明健脾消癥方能顯著提高H22細(xì)胞早期及晚期凋亡率。

腫瘤細(xì)胞的無限增殖，凋亡受限制主要源自于細(xì)胞周期的不可控制，細(xì)胞周期調(diào)控點主要為G1、G2及S期，此調(diào)控點也是眾多抗腫瘤藥物的主要作用靶點之一〔6〕。且有研究表明健脾消癥方能使MGC-803胃癌細(xì)胞周期阻滯于G2期〔7〕。所以本研究也利用流式細(xì)胞法探討健脾消癥方對H22細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明健脾消癥方能使H22細(xì)胞阻滯于DNA復(fù)制前期，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，與胡守友等〔7〕報道健脾消癥方在胃癌細(xì)胞中的作用不一致，可能是此方具有細(xì)胞作用特異性。細(xì)胞周期的變化受細(xì)胞周期相關(guān)蛋白調(diào)控，其中CyclinD1與CyclinE是與G1期最為密切相關(guān)的周期蛋白，CyclinD1于G1期開始表達(dá)并達(dá)到峰值，能與細(xì)胞周期依賴性蛋白(CDK)4/CDK6結(jié)合形

成復(fù)合物，促使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白Rb磷酸化，并使核轉(zhuǎn)錄因子E2F進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。CyclinE是在CyclinD1降解后在G1期中起主要促進(jìn)作用的周期蛋白，與CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，促使G1期向S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)DNA的復(fù)制。而p21和p27是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑的主要成員之一，p21能抑制CyclinD1與CDK4/CDK6的結(jié)合，阻滯細(xì)胞周期于G1期。p27能抑制CyclinE/CDK2復(fù)合物的形成，從而使細(xì)胞周期阻滯在G1期。本研究結(jié)果表明健脾消癥方能顯著下調(diào)CyclinD1及CyclinE表達(dá)，上調(diào)p21及p27表達(dá)，最終使H22細(xì)胞周期阻滯于G1期，進(jìn)而遏制細(xì)胞的無限增殖。

細(xì)胞的增殖、凋亡與多種信號通路相關(guān)，PI3K/AKT是其中一種，此信號通路被稱為“抗凋亡”信號途徑。PI3K是由催化亞單位p110和調(diào)節(jié)亞單位p85組成的二聚體，能夠?qū)⑾掠蔚孜锒姿崃字＜〈?PIP2)的3′羥基磷酸化，使之成為三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3進(jìn)而促使AKT蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并磷酸化，而活化后的AKT能夠激活下游靶基因，如Bcl-2家族，Cyclin，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖，凋亡，細(xì)胞周期等生物學(xué)行為〔8〕。研究顯示PI3K/AKT在包括肝癌在內(nèi)的眾多腫瘤組織中被高度激活，并成為眾多抗腫瘤藥物的作用信號通路〔5〕。本研究結(jié)果表明健脾消癥方能顯著下調(diào)PI3K及p-AKT表達(dá)，最終抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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2何立麗,呂文良,孫桂芝.中藥提取物抗原發(fā)性肝癌的研究進(jìn)展〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2014;29(4):1175-8.

3Meng MB,Wen QL,Cui YL,etal.Meta-analysis:traditional Chinese medicine for improving immune response in patients with unresectable hepatocellular carcinoma after transcatheter arterial chemoembolization〔J〕.Explore(NY),2011;7(1):37-43.

4吳堅,張星星,顧培青,等.健脾消癥方誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的作用研究〔J〕.江蘇中醫(yī)藥,2017;49(2):79-82.

5徐同磊,謝淑麗,王廣義.肝癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的最新進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013;33(7):1724-6.

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7胡守友,劉沈林,吳堅,等.健脾消癥方對人胃癌細(xì)胞MGC803凋亡和細(xì)胞周期的影響〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志,2012;39(12):2342-4.

8Spangle JM,Roberts TM,Zhao JJ.The emerging role of PI3K/AKT-mediated epigenetic regulation in cancer〔J〕.Biochim Biophys Acta,2017;1868(1):123-31.