吳　丹　李潔芳　肖玉坤　胡　燦　伍亞男　李　茜　劉　君

(長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院中醫(yī)科，湖南　長(zhǎng)沙　410006)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)以炎性滑膜炎為主要特征，臨床表現(xiàn)為手、足的多個(gè)大關(guān)節(jié)和小關(guān)節(jié)出現(xiàn)疼痛、腫脹等現(xiàn)象，同時(shí)受累關(guān)節(jié)在清晨出現(xiàn)僵硬，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)畸形〔1〕。隨著病情的發(fā)展，骨骼會(huì)受到持續(xù)性破壞，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失，最終殘疾。RA在中醫(yī)領(lǐng)域被認(rèn)為是尪痹類疾病，補(bǔ)腎祛寒治尪湯是一種主治尪痹腎虛寒盛證的方劑，常用于治療RA、強(qiáng)直性脊柱炎、結(jié)核性關(guān)節(jié)炎等疾病，具有補(bǔ)腎祛寒、散風(fēng)祛濕、活血通絡(luò)的功效〔2〕。甲氨蝶呤是一種葉酸還原酶抑制劑，對(duì)RA有較好的治療效果〔3〕。為進(jìn)一步探究補(bǔ)腎祛寒治尪湯治療RA的機(jī)制，本研究建立了膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，分析補(bǔ)腎祛寒治尪湯對(duì)模型大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-2及腫瘤壞死因子(TNF)-α水平的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取健康清潔級(jí)SD大鼠75只，鼠齡45～50 d，體重(200±20)g，光照時(shí)間為6：00～18：00，環(huán)境噪音控制在(40±10)db，溫度控制在(20±3)℃，期間大鼠均自由飲食、飲水，正常飼養(yǎng)1 w，待大鼠適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。大鼠均由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2儀器和試劑牛Ⅱ型膠原、醋酸水(北京博蕾德生物科技有限公司)；完全弗氏佐劑(上海偉進(jìn)生物科技有限公司)；一抗、二抗、酶聯(lián)免疫試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液、二甲苯(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3分組與建模方法75只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(15只)、模型對(duì)照組(20只)、甲氨蝶呤組(20只)和補(bǔ)腎祛寒治尪湯組(20只)。除正常對(duì)照組外的大鼠均進(jìn)行膠原誘導(dǎo)造模〔4〕，方法如下：將牛Ⅱ型膠原(10 mg)與0.1 mol/L醋酸水(5 ml)均勻混合，配制成濃度為2 mg/ml的溶劑，置于4℃的環(huán)境下過(guò)夜，將5 ml上述溶劑與5 ml完全弗氏佐劑(CFA)均勻混合，置于4℃環(huán)境中直至完全乳化，配制成濃度為1 mg/ml的乳化液，給大鼠注射乳化液進(jìn)行初次免疫，分別從尾根部選取1個(gè)點(diǎn)、任選一后足掌選取1個(gè)點(diǎn)、背部選取3個(gè)點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，0.2 ml/只；在初次免疫后第7天再次進(jìn)行皮下注射乳化液。正常對(duì)照組大鼠在相同的時(shí)間皮下注射等劑量的生理鹽水。通過(guò)病理組織檢測(cè)來(lái)判斷建模是否成功。

1.4藥物制備

1.4.1補(bǔ)腎祛寒治尪湯制備參考焦樹德〔5〕編著的《焦樹德臨床經(jīng)驗(yàn)輯要》制備補(bǔ)腎祛寒治尪湯，所有藥材經(jīng)專家鑒定均符合中國(guó)藥典2005年版一部的規(guī)定。主要成分：松節(jié)15 g、炙山甲9 g、地鱉蟲10 g、熟地20 g、制附片9 g、羌活10 g、骨碎補(bǔ)18 g、桂枝10 g、白芍15 g、知母12 g、獨(dú)活10 g、威靈仙15 g、川斷15 g、防風(fēng)10 g、補(bǔ)骨脂15 g、麻黃6 g、伸筋草20 g、赤芍10 g、淫羊藿10 g、蒼術(shù)10 g、川牛膝12 g，共含生藥261 g。配好藥方后進(jìn)行常規(guī)煎煮，湯藥濃縮至90 ml，含生藥量為2.9 g/ml，于4℃的環(huán)境下保存待用。

1.4.2甲氨蝶呤混懸液制備將甲氨蝶呤片(湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19983205，規(guī)格：2.5 mg/片)磨研成粉末，加入無(wú)菌蒸餾水混合均勻，配制成濃度為0.2 mg/ml的藥物混懸液。

1.5給藥方法所有大鼠在初次免疫后的15 d進(jìn)行灌胃給藥。正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予無(wú)菌蒸餾水灌胃，10 ml/kg，1次/d，連續(xù)28 d。甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤混懸液灌胃，10 ml/kg，1次/d，連續(xù)28 d。補(bǔ)腎祛寒治尪湯組給予補(bǔ)腎祛寒治尪湯灌胃，10 ml/kg，1次/d，連續(xù)28 d。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1大鼠的一般狀態(tài)觀察各組大鼠的一般狀態(tài)，包括活動(dòng)量、食欲、體重、毛色、關(guān)節(jié)腫脹情況等。

1.6.2關(guān)節(jié)腫脹度在用藥前、用藥14 d后和28 d后采用足容積檢測(cè)儀測(cè)量大鼠的足容積，并計(jì)算其關(guān)節(jié)腫脹度，關(guān)節(jié)腫脹度=用藥前后的足容積之差/治療前足容積。

1.6.3染色處理在用藥28 d后，給予10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，將大鼠處死。取下大鼠的后爪(包括踝關(guān)節(jié))、雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，將其肌纖維和毛皮剪掉，浸泡在10%中性甲醛中固定24 h；標(biāo)本固定好后，將其置于14%EDTA脫鈣液中脫鈣5 d，脫鈣完成后使用5%硫代硫酸鈉液進(jìn)行中和處理，水洗12 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。蠟塊縱切成5～6 μm的切片，將其放置在60℃烤箱中烘烤30 min，進(jìn)行HE染色和TRAP 染色，中性樹脂封片，在400倍高倍鏡下觀察。

1.6.4酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定IL-1、IL-2及TNF-α水平在用藥28 d后，斷頭取血，血液標(biāo)本在2℃～8℃、3 000 r/min離心15 min，取上清。按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)：將抗體包埋在酶標(biāo)板孔內(nèi)，加入100 μl待檢標(biāo)本，在37℃的環(huán)境下孵育1 h，使用洗漆液進(jìn)行洗漆處理，加入生物素2抗體結(jié)合物，在37℃的環(huán)境下孵育1 h，進(jìn)行洗漆處理，加入親和素2酶結(jié)合物，在37℃的環(huán)境下孵育30 min，進(jìn)行洗漆處理，加入TMB底物溶液，顯色20 min后終止反應(yīng)。由試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算機(jī)擬合，自動(dòng)計(jì)算每一樣品中細(xì)胞因子的濃度。

2　結(jié)　果

2.1各組一般狀態(tài)比較正常對(duì)照組大鼠一切正常，毛發(fā)光亮，精神狀態(tài)好，活動(dòng)量較大，食欲較強(qiáng)，體重?zé)o明顯變化，關(guān)節(jié)無(wú)腫脹。模型對(duì)照組大鼠毛發(fā)稀松且光澤度較差，精神萎靡，食欲不振，活動(dòng)極少，體型瘦小，關(guān)節(jié)腫脹明顯。甲氨蝶呤組和補(bǔ)腎祛寒治尪湯組大鼠毛發(fā)光澤度一般，精神狀態(tài)良好，活動(dòng)較少，食欲一般，體重較輕，有一定程度的關(guān)節(jié)腫脹。

2.2各組關(guān)節(jié)腫脹度比較用藥14 d、28 d后，其他3組關(guān)節(jié)腫脹度均顯著高于正常對(duì)照組，甲氨蝶呤組和補(bǔ)腎祛寒治尪湯組顯著低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；用藥28 d后補(bǔ)腎祛寒治尪湯組關(guān)節(jié)腫脹度顯著低于甲氨蝶呤組(P<0.05)；隨著時(shí)間的推移，模型對(duì)照組的關(guān)節(jié)腫脹度顯著增加，甲氨蝶呤組和補(bǔ)腎祛寒治尪湯組的關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型對(duì)照組比較：2)P<0.05；與甲氨蝶呤組比較：3)P<0.05；與用藥14 d比較：4)P<0.05

2.3各組關(guān)節(jié)病理情況對(duì)比正常對(duì)照組大鼠的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)軟骨正常，軟骨細(xì)胞無(wú)壞死，關(guān)節(jié)腔間隙正常；模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨面破壞明顯，大量軟骨細(xì)胞出現(xiàn)壞死、腫脹，關(guān)節(jié)腔間隙狹窄；滑膜增厚、腫脹，細(xì)胞呈多層排列，滑膜中可見新生血管翳。甲氨蝶呤組大鼠關(guān)節(jié)軟骨面受到破壞，部分軟骨細(xì)胞出現(xiàn)壞死、腫脹，關(guān)節(jié)腔間隙稍變狹窄，滑膜增生，且部分滑膜中可見新生血管翳。補(bǔ)腎祛寒治尪湯組大鼠關(guān)節(jié)軟骨面受到破壞，少量軟骨細(xì)胞出現(xiàn)壞死、腫脹，關(guān)節(jié)腔間隙稍變狹窄，滑膜增生，少量滑膜中可見新生血管翳。

2.4各組血清IL-1、IL-2及TNF-α水平比較用藥28 d后，模型對(duì)照組IL-1、IL-2及TNF-α水平顯著高于其他3組(P<0.05)，甲氨蝶呤組和補(bǔ)腎祛寒治尪湯組IL-1、IL-2及TNF-α水平顯著高于正常對(duì)照組，補(bǔ)腎祛寒治尪湯組IL-1、IL-2及TNF-α水平顯著低于甲氨蝶呤組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠血清IL-1，IL-2及TNF-α水平比較

與正常對(duì)照組比較:1)P<0.05；與模型對(duì)照組比較:2)P<0.05；與甲氨蝶呤組比較:3)P<0.05

3　討　論

RA是一種進(jìn)展性骨破壞的骨科疾病，在正常人體內(nèi)，骨組織可以通過(guò)正常的重塑過(guò)程對(duì)自身的微損傷進(jìn)行修復(fù)，維護(hù)骨骼結(jié)構(gòu)的正常，保證骨骼載荷能力，但在RA患病關(guān)節(jié)可產(chǎn)生細(xì)胞水平和分子水平的物質(zhì)介質(zhì)，來(lái)干擾重塑過(guò)程，并且對(duì)骨組織進(jìn)行破壞，其中破骨細(xì)胞的異常表達(dá)與骨組織的破壞有直接的關(guān)系〔6〕。中醫(yī)認(rèn)為RA屬于尪痹類疾病，主要由于患者體內(nèi)濕邪入侵、正氣不足，導(dǎo)致關(guān)節(jié)脈絡(luò)處出現(xiàn)風(fēng)濕寒熱，脈絡(luò)受阻，進(jìn)一步導(dǎo)致氣血運(yùn)行受阻，最終關(guān)節(jié)出現(xiàn)僵硬、腫脹、疼痛的病態(tài)，而治療的思路主要為通絡(luò)活血、散風(fēng)祛濕、除濕止痛、補(bǔ)腎驅(qū)寒〔7〕。西醫(yī)認(rèn)為RA是屬于自身免疫性疾病，主要由于局部骨組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致骨組織周圍免疫微環(huán)境出現(xiàn)變化，進(jìn)而導(dǎo)致骨組織出現(xiàn)病變，軟骨面被破壞，大量軟骨細(xì)胞出現(xiàn)壞死、腫脹，同時(shí)滑膜增厚、腫脹，出現(xiàn)新生血管翳〔8〕。

本次研究采用經(jīng)典的膠原誘導(dǎo)方式成功建造RA大鼠模型，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，與模型對(duì)照組相比，在一般狀態(tài)和病理變化上甲氨蝶呤組和補(bǔ)腎祛寒治尪湯組均有所改善，這提示兩種用藥方法均能對(duì)RA模型大鼠起到一定的治療效果。本研究結(jié)果說(shuō)明甲氨蝶呤和補(bǔ)腎祛寒治尪湯均能有效降低RA模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度和血清中IL-1，IL-2及TNF-α水平，且補(bǔ)腎祛寒治尪湯的效果更好。究其原因，IL-1、IL-2及TNF-α均是炎癥相關(guān)因子，可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，使內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)增強(qiáng)，增加關(guān)節(jié)腔內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，產(chǎn)生膠原酶，釋放骨鈣，進(jìn)而對(duì)軟骨面造成破壞〔9〕。甲氨蝶呤是一種免疫抑制劑，具有免疫抑制作用，同時(shí)可以影響炎性細(xì)胞增殖和凋亡，降低關(guān)節(jié)滑膜組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的水平，進(jìn)而降低MMPs對(duì)軟骨面的破壞，改善RA癥狀，減少關(guān)節(jié)腫脹度〔10，11〕。補(bǔ)腎祛寒治尪湯由21味中藥組成，其中川斷和補(bǔ)骨脂具有補(bǔ)腎和強(qiáng)精壯骨的作用，骨碎補(bǔ)和淫羊藿具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)的作用，桂枝、獨(dú)活和威靈仙能有效祛除肢體風(fēng)寒濕邪，其余藥物多具有散風(fēng)、散寒、祛濕、壯骨等作用，連續(xù)用藥后可通絡(luò)活血、散風(fēng)祛濕、補(bǔ)腎驅(qū)寒，進(jìn)而改善RA大鼠癥狀，減少炎癥因子水平〔12〕。

綜上所述，補(bǔ)腎祛寒治尪湯能降低膠原誘導(dǎo)mRNA大鼠血清IL-1、IL-2及TNF-α水平，改善關(guān)節(jié)腫脹度，治療效果明顯。

1鄒惠美，成沛玉，王蓉，等.艾拉莫得治療大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的療效及可能機(jī)制〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2016；36(5)：1061-3.

2趙小民，黃興民，金海歐.補(bǔ)腎祛寒治尪湯輔以中藥熏蒸及穴位敷貼治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床研究〔J〕.四川中醫(yī)，2017；36(1)：80-3.

3李連菊，王京旭.艾拉莫德分別聯(lián)合甲氨蝶呤和雙醋瑞因?qū)﹄y治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者相關(guān)指標(biāo)的影響比較〔J〕.中國(guó)藥房，2017；28(6)：769-72.

4葉霖，皮慧，王友蓮，等.蠲痹湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清和滑膜Fas/FasL系統(tǒng)的影響〔J〕.山西醫(yī)藥雜志，2017；46(5)：503-6.

5焦樹德.焦樹德臨床經(jīng)驗(yàn)輯要〔M〕.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2001：37-42.

6Zhang L，Wang J，Zhang Q，etal.Factors associated with hand joint destruction in Chinese patients with rheumatoid arthritis〔J〕.BMC Musculoskelet Disord，2017；18(1)：211.

7董玢，婁利霞，韋翊麗，等.益氣活血解毒中藥對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015；38(10)：686-9，702，721.

8張明生，穆永慧，陳清漢，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014；31(5)：1091-3.

9劉貴艷，邊森，李芳，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜中白細(xì)胞介素-22及基質(zhì)金屬蛋白酶-3表達(dá)的影響〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2017；97(9)：698-702.

10羅東萍，劉秀梅，傅自力，等.他克莫司聯(lián)合甲氨蝶呤治療難治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床分析〔J〕.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2017；21(3)：185-7.

11趙小瑩，白寧.甲氨蝶呤聯(lián)合阿達(dá)木單抗治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效觀察〔J〕.疑難病雜志，2014；13(4)：381-4.

12田鑫，嚴(yán)澤，王偉鋼，等.補(bǔ)腎祛寒治尪湯及其拆方對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠治療作用的研究〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2014；29(2)：629-31.