陳德才　王　雅　馬從乾　楊　軻　陳　輝　陳德霞

(南陽市中心醫(yī)院血管外科，河南　南陽　473000)

1南陽市中心醫(yī)院腎內(nèi)科2南陽市方城縣人民醫(yī)院血液凈化科

血管瘤主要由先天性遺傳疾病或血管畸形造成，嬰幼兒時(shí)期多為良性腫瘤，成人時(shí)期多為惡性肉瘤，發(fā)病率為5%～10%〔1〕。研究表明，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的過度增殖和血管病理性形成是其主要的生物學(xué)特性〔2〕。血管瘤的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞比正常內(nèi)皮細(xì)胞侵襲、遷移能力更強(qiáng)〔3〕。研究表明雷帕霉素靶蛋白(mTOR)與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、侵襲、凋亡等過程密切相關(guān)〔4〕。 mTOR由mTOR復(fù)合物1和mTOR復(fù)合物2組成，mTOR雷帕霉素不敏感組分(RICTOR)是mTOR復(fù)合物2的支架蛋白〔5〕。研究表明mTOR復(fù)合物1和mTOR復(fù)合物2在腫瘤組織中高表達(dá)，推測(cè)RICTOR可能與血管瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)〔6〕。本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾技術(shù)沉默RICTOR基因表達(dá)研究其對(duì)血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞EOMA侵襲、遷移能力的影響及作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞購自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，高糖DMEM、胎牛血清(FBS)、絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)抗體、磷酸化AKT(p-AKT)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9抗體購自中國Solarbio公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Annexin V FITC PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將EOMA凍存管置于37℃水浴鍋中，迅速融化，離心，收集細(xì)胞，加入含10%FBS和青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃、95%濕度的孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞的貼壁面積至70%～80%匯合時(shí)，使用2 ml 0.25%胰酶消化細(xì)胞，加入不完全DMEM培養(yǎng)基終止消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次，加入新鮮培養(yǎng)基，以1∶3的比例傳代。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，胰酶消化，以1×106個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔板，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒的轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，陰性組(轉(zhuǎn)染siRNA-NC)，轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染siRNA-RICTOR，轉(zhuǎn)染后在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，然后將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果)。

1.3Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲、遷移能力實(shí)驗(yàn)前，使用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠(1 mg/ml)，取100 μl基質(zhì)膠加入到Transwell小室上室中，37℃孵育5 h，取1×105個(gè)細(xì)胞提前饑餓處理，加入Transwell小室上室中，下室中加入600 μl 含15% FBS的培養(yǎng)基，置于24孔板中，放入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，棉簽輕輕拭去上室中未侵襲的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。遷移實(shí)驗(yàn)為細(xì)胞接種于未鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室中，其余步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.4Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中AKT、p-AKT、MMP-9蛋白表達(dá)水平取轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基上清，PBS清洗2次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解10 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，檢測(cè)總蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，100℃變性3 min。將10%分離膠和4%濃縮膠置于干凈的電泳槽中，每個(gè)上樣孔加入20 μg蛋白，電壓調(diào)至120 V進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部，停止電泳，切下分離膠，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗，加入Western封閉液，置于搖床中封閉2 h，加入適當(dāng)比例稀釋的一抗，混勻，4℃孵育過夜。TBST清洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10～15 min。加入化學(xué)發(fā)光試劑，避光孵育5 min，顯影30 s，定影10 s，沖洗晾干，使用Image-J軟件分析蛋白質(zhì)的電泳條帶灰度值，與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1Western印跡檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果與對(duì)照組(1.156±0.220)相比，陰性組細(xì)胞中RICTOR蛋白表達(dá)量(1.123±0.262)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，轉(zhuǎn)染組(0.433±0.029)顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1　轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中RICTOR蛋白的表達(dá)量

2.2Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲、遷移能力與對(duì)照組細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)〔(60.865±6.539)個(gè)、(105.480±10.644)個(gè)〕相比，陰性組〔(63.489±5.782)個(gè)、(99.569±8.623)個(gè)〕差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，轉(zhuǎn)染組〔(12.635±2.456)個(gè)、(46.103±6.942)個(gè)〕顯著降低(P<0.05)。

2.3Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中AKT、p-AKT、MMP-9蛋白表達(dá)水平干預(yù)RICTOR表達(dá)對(duì)細(xì)胞中AKT蛋白的表達(dá)沒有顯著影響；與對(duì)照組相比，陰性組細(xì)胞中p-AKT、MMP-9蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，轉(zhuǎn)染組顯著下降(P<0.05)。見圖2，表1。

圖2　轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中AKT、p-AKT、MMP-9蛋白表達(dá)量

組別AKTp?AKTMMP?9對(duì)照組0789±00540546±00480465±0028陰性組0775±00630559±00630483±0056轉(zhuǎn)染組0750±00580306±00421)0260±00331)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

3　討　論

腫瘤預(yù)后和復(fù)發(fā)的主要原因是細(xì)胞的侵襲、遷移能力增強(qiáng)。細(xì)胞的侵襲、遷移過程復(fù)雜，受多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)移基因、轉(zhuǎn)移抑制基因、細(xì)胞外基質(zhì)降解等的影響，主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶侵襲進(jìn)入基底膜向周圍間質(zhì)生長(zhǎng)，經(jīng)過毛細(xì)血管或淋巴管壁與血小板反應(yīng)生成小瘤栓，隨著全身血液的運(yùn)輸黏附血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，穿越管壁不斷增殖，形成新的腫瘤灶〔7〕。研究認(rèn)為mTOR信號(hào)通路參與細(xì)胞周期、生長(zhǎng)、細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)降解和膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等過程〔8〕。RICTOR是一種新發(fā)現(xiàn)的mTOR復(fù)合物2功能蛋白之一，保守性較低，對(duì)雷帕霉素的敏感度較低，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、分化、周期等過程〔9〕。研究顯示miR-424/503可通過影響RICTOR的表達(dá)量抑制多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，RICTOR也可促進(jìn)c-Myc和細(xì)胞周蛋白E的表達(dá)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期〔10〕。研究表明，RICTOR與整合素連接激酶結(jié)合抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔11〕。但RICTOR基因在血管瘤中的研究較少。結(jié)果顯示沉默RICTOR表達(dá)可抑制EOMA細(xì)胞侵襲、遷移力。

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞的存活、凋亡、侵襲、遷移等多種生理病理過程，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等發(fā)揮重要作用。PI3K是這一信號(hào)通路的主要因子，能活化細(xì)胞內(nèi)的磷脂酰肌醇，使其具有第二信使的作用，從而激活下游靶基因的表達(dá)〔12〕。AKT是PI3K下游最關(guān)鍵的靶向激酶，PI3K磷酸化產(chǎn)物可使AKT轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘膒-AKT，活化的AKT通過胞質(zhì)內(nèi)因子傳遞生物信息學(xué)信號(hào)，激活或抑制下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞周期、增殖、侵襲等過程發(fā)揮調(diào)控作用〔13〕。 MMP-9是金屬離子Zn依賴的蛋白水解酶超家族的重要成員之一，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)具有降解作用。在細(xì)胞侵襲過程中，細(xì)胞外基質(zhì)基底膜的降解是關(guān)鍵。研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路可激活MMP-9的表達(dá)從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔14〕。本研究結(jié)果提示，沉默RICTOR可通過降低PI3K/AKT信號(hào)通路，下調(diào)MMP-9表達(dá)，從而有效抑制血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力，為血管瘤的分子治療提供一定的理論依據(jù)，但本實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，還需進(jìn)一步研究RICTOR在體內(nèi)試驗(yàn)的作用效果。

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