王錫麟　劉若蘭　沈　沉　周　華　孫國杰　沈　峰

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，湖北　武漢　430000)

1武漢大學(xué)中南醫(yī)院2湖北省中醫(yī)院

炎癥在阿爾茨海默病(AD)發(fā)生發(fā)展過程中的重要地位已被基礎(chǔ)研究證實〔1〕。作為AD病理過程的最初事件，β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積誘發(fā)包括神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生、炎癥細胞和細胞因子激活在內(nèi)的一系列炎癥反應(yīng)，促使神經(jīng)細胞死亡或加速死亡，引起一系列臨床癥狀，是AD發(fā)病過程中重要的病理機制〔2〕。本研究觀察低頻電針對AD模型大鼠炎癥相關(guān)因子白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的影響，以期探討電針對抗AD大鼠學(xué)習記憶功能障礙的炎癥機制。

1　材料與方法

1.1動物分組雄性SPF級Wistar大鼠30只，鼠齡(12±2)月齡，體重(360±20)g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。購入后分籠飼養(yǎng)于安靜、清潔的環(huán)境下，相對濕度為60%，相對溫度控制在(22±2)℃，按時給以飲水和飼料。常規(guī)喂養(yǎng)1 w后，大鼠無任何不良反應(yīng)，即行Morris水迷宮實驗，剔除反應(yīng)過于敏感或遲鈍的大鼠。隨機選取30只大鼠分為假手術(shù)組、模型組和電針組各10只。

1.2主要儀器和主要試劑主要儀器：腦立體定位儀(編號89-00136，西安西北光電儀器廠)，牙科鉆(成都康發(fā)醫(yī)療器械有限公司)，韓式疼痛治療儀(型號HANS-100A，南京濟生醫(yī)療科技有限公司)，GC-1200γ放免計數(shù)器(中國科技大學(xué)科技實業(yè)總公司)，日產(chǎn)Olympus BX50光學(xué)顯微鏡，HPIAS-2000型全自動醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限責任公司)，Aβ25～35(美國Sigma公司)，IL-1β、TNF-α抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，免疫組化(SP)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，125I-IL-1β、TNF-α試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所，批號20120420)。

1.3造模方法凝聚態(tài)Aβ25～35的孵育：將0.1 mg的Aβ25～35用二甲基亞砜50 μl溶解，再用0.1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)50 μl稀釋配制成濃度為10 μg/μl的溶液，密封后置于37℃溫箱孵育1 w，觀察其出現(xiàn)明顯的絮狀形態(tài)，表明此時的Aβ25～35為凝聚態(tài)，孵育完成，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩D模型采用雙側(cè)海馬一次性注射聚集態(tài)Aβ25～35的方法制備。Wistar大鼠稱重，腹腔注射10%的水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，頭頂部常規(guī)備皮，消毒并剪開頭皮，分離皮下組織，暴露顱骨找到前囟位置，再將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，固定時注意保持大鼠前后囟在同一水平。定位海馬區(qū)(前囟后3.5 mm，左右旁開2 mm，腦膜表面下2.7 mm)用牙科鉆鉆孔穿顱，將1 μl的微量進樣器垂直進針到達海馬區(qū)，左右兩側(cè)各緩慢注入凝聚態(tài)的Aβ25～35，每側(cè)10 μg，注射速度控制在0.2 μl/min，完畢后留針5 min后緩慢出針，以使Aβ25～35充分浸潤局部組織。術(shù)后常規(guī)縫合2～3針，碘伏外擦消毒以預(yù)防感染。

1.4干預(yù)方法 造模后第7天開始，電針組定取腎俞穴(第二腰椎下兩旁)、大椎穴(第七頸椎與第一胸椎間，背部正中)、內(nèi)關(guān)穴(前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm，左右的尺橈骨縫間)，使用28號1寸華佗牌無菌毫針，腎俞穴直刺5 mm、大椎穴斜刺5 mm、內(nèi)關(guān)穴斜刺3 mm，同側(cè)腎俞穴、內(nèi)關(guān)穴接韓式電針儀，強度為1 mA，選擇2 Hz連續(xù)波，通電治療20 min，每周連續(xù)治療6次，6 d為1個療程，療程間隔1 d，共治療2個療程。模型組同電針組，每次進行抓取固定等刺激。假手術(shù)組同模型組，注射等量的生理鹽水，其余操作同模型組。

1.5血清IL-1β、TNF-α的檢測完成行為學(xué)檢測后第2天，大鼠眼球常規(guī)取血，分離血清，離心取上清液-20℃保存。放射免疫法檢測大鼠血清IL-1β、TNF-α。按照試劑盒步驟，γ計數(shù)器上測定血清沉淀的每分放射性脈沖數(shù)(cpm)。根據(jù)IL-1β、TNF-α標準品的標準曲線圖，測算出樣品的比放射性，求出相應(yīng)樣品的IL-1β、TNF-α濃度。

1.6海馬IL-1β、TNF-α的檢測大鼠取血后，脫頸處死，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片。采用SP法檢測海馬IL-1β、TNF-α的表達。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析Olympus BX50光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α蛋白陽性反應(yīng)細胞并攝像。于物鏡40倍下，每張切片選取相鄰3個視野，用HPIAS-2000型全自動醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)對IL-1β、TNF-α陽性染色強度進行定量分析，測定其灰度值，計算每組標本的平均灰度值。平均灰度值越小，說明相應(yīng)蛋白表達越強。采用SPSS11.0軟件進行方差分析。

2　結(jié)　果

2.1各組血清IL-1β、TNF-α的表達與假手術(shù)組相比，模型組血清IL-1β、TNF-α明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，電針組血清IL-1β、TNF-α含量顯著減少(P<0.01)。見表1。

表1　各組血清IL-1β、TNF-α水平比較

與模型組比較:1)P<0.01；與假手術(shù)組比較:2)P<0.01

2.2各組海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α蛋白的表達各組海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α蛋白均有陽性表達，胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色深染。與假手術(shù)組相比，模型組海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α蛋白表達明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，電針組海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α蛋白顯著減少(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表2　各組海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α表達

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

3　討　論

AD主要表現(xiàn)為進行性記憶力減退和智力下降，以腦組織萎縮、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)和老年斑(SP)為主要病理改變。其中，Aβ在腦內(nèi)沉積形成SP是AD的發(fā)病基礎(chǔ)。研究〔3〕證實，在Aβ異常沉積形成SP的周圍，不但有神經(jīng)退行性病變，同時還存在著膠質(zhì)細胞(包括小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞)的活化，表明AD過程中腦內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)過程。異常沉積的Aβ被認為是引起炎癥免疫反應(yīng)的誘發(fā)和激發(fā)因子〔4〕。目前認為，Aβ刺激小膠質(zhì)細胞(MG)產(chǎn)生的慢性炎癥反應(yīng)〔5〕，導(dǎo)致的凋亡是腦神經(jīng)元缺失的重要機制，與AD的發(fā)病密切相關(guān)。流行病學(xué)的資料〔6〕研究表明，臨床上使用的非甾體類抗感染藥物可以降低AD發(fā)病率。研究〔7,8〕提示，包括TNF-α、IL-1、IL-6等因子在內(nèi)的炎性介質(zhì)與AD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

IL-1不僅參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，也直接參與炎癥過程，具有廣泛的生物學(xué)功能〔9〕。在AD中，IL-1β過度表達促進Aβ的進一步沉積，加速AD的不斷惡化〔10〕。IL-1β中存在兩個可變位點：-551和+3953。IL-1β(-551)T/T基因型和遲發(fā)性AD的提早發(fā)病有關(guān)，且可以增加血漿中IL-1β的表達〔11〕。IL-1β(+3953)T/T型能提高遲發(fā)性AD的發(fā)病率〔12〕。因此，IL-1被認為是AD潛在的炎癥標記物〔13〕。

TNF-α可以誘導(dǎo)其他細胞因子的產(chǎn)生(如IL-1等)，并協(xié)同IL-1 強烈誘導(dǎo)IL-6 產(chǎn)生，使淀粉樣前體蛋白(APP)增加，Aβ 沉積。臨床資料〔14〕表明，在AD患者的外周血和腦脊液中，TNF-α的表達量異常升高，說明其過表達與AD關(guān)系密切。方芳等〔15〕研究也表明，炎癥反應(yīng)參與了認知功能的損害，并認為通過對炎癥因子的檢測有助于癡呆患者的早期診斷和治療。系列AD轉(zhuǎn)基因動物模型發(fā)現(xiàn)，TNF-α過度表達能加重Aβ沉積，引起慢性炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變和行為的異?！?6〕。

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