鄭亞光 閆素梅 史彬林 張博綦 趙艷麗

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018)

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用得到的。甲殼素又稱甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)，是1811年由法國化學家Henri Braconnot首先從蘑菇中分離的，是最早知道的多糖，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是世界上第二大豐富的天然生物聚合物，其中海洋生物儲量達到106～107t[1]。甲殼素可被強酸分解成乙酸和殼聚糖，也可以通過纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶和殼聚糖酶等非特異性酶作用，進一步生成殼聚糖和氨基葡萄糖2個主要衍生物[2]。殼聚糖或幾丁質(zhì)通過酸水解和酶降解方法可得到幾丁質(zhì)寡糖(chitin oligosaccharide，NACOS)和殼聚糖寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)。大量研究表明，殼聚糖是一類具有抗細菌、抗真菌、抗糖尿病、抗癌和降膽固醇特性的生物活性陽離子多糖，同時具有抗氧化與抗炎癥作用，對飼料中綠色飼料添加劑的開發(fā)應(yīng)用具有重要的意義；殼聚糖的衍生物NACOS和COS的水解產(chǎn)物易溶于水，在中性pH下具有低黏度和較高溶解度，由于氫鍵的作用減弱，顯示出更好的抗氧化活性，使得其在生產(chǎn)和研究中的應(yīng)用更加廣泛[3-4]。本文綜述了殼聚糖及其衍生物抗氧化、抗炎癥等作用的相關(guān)機制，為其深入研究及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 殼聚糖及其衍生物的抗氧化與抗炎癥作用

殼聚糖及其衍生物具有重要的生物抗氧化作用，在體內(nèi)研究中，殼聚糖通過降低全身循環(huán)中的氧化應(yīng)激指標水平，表現(xiàn)出直接的抗氧化活性。大鼠飼糧中補充殼聚糖可減弱心肌中由于異丙腎上腺素誘導的氧化應(yīng)激，并增強幼齡和老年大鼠的谷胱甘肽(GSH)依賴型抗氧化系統(tǒng)，從而提高抗衰老作用[5]。在小鼠巨噬細胞的研究中證實，NACOS對骨髓細胞中的髓過氧化物酶(MPO)活性具有抑制作用[6]。NACOS提高細胞內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性和GSH含量，表明NACOS在活細胞中可以作為有效的抗氧化劑[7]。研究表明，COS可抑制鼠黑素瘤細胞系中細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生，誘導細胞內(nèi)GSH含量增加，對基因組DNA的氧化損傷具有保護作用[8]。COS對過氧化氫誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的氧化損傷具有保護作用，活性氧(reactive oxygen species，ROS)可氧化生物分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物和DNA等，是引起細胞氧化應(yīng)激的主要自由基之一[9]，除了細胞內(nèi)ROS水平的顯著降低外，COS還對脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如丙二醛的產(chǎn)生具有抑制作用，恢復內(nèi)源性抗氧化劑(包括超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶)的活性，提高一氧化氮(NO)承載力和誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)活性，說明COS可以有效地保護HUVEC免受過氧化氫的氧化應(yīng)激，提示COS在預(yù)防和治療心血管疾病中將發(fā)揮重要的作用[10]。COS能夠保護人胚胎肝細胞免受過氧化氫誘導的氧化應(yīng)激，表明COS對臨床肝損傷期間可能存在的氧化應(yīng)激具有減緩作用[11]。

研究表明，在干乳期奶牛基礎(chǔ)飼糧中添加殼聚糖，可顯著提高血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)的含量，提示殼聚糖可以作為奶牛的免疫增強劑[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖可以顯著提高奶牛的4%標準乳產(chǎn)量，提高血液中活性T淋巴細胞、B淋巴細胞含量，顯著提高血清中IgM、IgG含量[13]。飼糧中添加一定劑量的殼聚糖可顯著提高奶牛的產(chǎn)奶量，降低乳中體細胞數(shù)，并可增強奶牛的抗氧化能力，血清超氧化物歧化酶(SOD)活性與總抗氧化能力(T-AOC)均呈明顯的升高趨勢[14]；殼聚糖可能通過提高抗氧化能力緩解斷奶應(yīng)激，進而促進了斷奶仔豬的免疫功能[15]；對肉牛的試驗也發(fā)現(xiàn)，飼糧中適宜劑量的殼聚糖可提高肉牛的抗氧化和免疫功能[16]。殼聚糖對肉仔雞生長和免疫的影響與添加量有關(guān)。飼糧添加0.05%殼聚糖時，可明顯提高肉仔雞的生長性能；而添加更高水平殼聚糖時，雖免疫功能有所增強，但生長性能卻有下降趨勢。因此，0.05%可看作殼聚糖的適宜添加量。此外，適宜添加量的殼聚糖可在一定程度上改善肉仔雞的腸道微生態(tài)環(huán)境[17]。另有試驗研究了蛋雞飼糧中添加不同水平殼聚糖對蛋品質(zhì)及蛋黃抗氧化指標的影響，飼糧中適宜添加量的殼聚糖可在一定程度上改善蛋雞的蛋品質(zhì)和蛋黃的抗氧化指標，還可以降低脂肪酶活性和粗脂肪表觀代謝率，提高蛋白酶活性和其他營養(yǎng)物質(zhì)的表觀代謝率[18]。COS可減輕試驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠的眼部炎癥，通過減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)預(yù)防視網(wǎng)膜缺血和灌注損傷[19]。飼糧中適宜添加量的殼聚糖能夠促進斷奶仔豬的生長，降低腹瀉，緩解斷奶應(yīng)激[20]。

2 殼聚糖及其衍生物的抗氧化應(yīng)激與抗炎癥作用機制

2.1 通過調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)因子發(fā)揮抗炎癥作用

腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種單核因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，巨噬細胞在分泌NO和促炎細胞因子如TNF-α和白細胞介素-6(IL-6)的免疫應(yīng)答中起重要作用[21]。巨噬細胞被脂多糖(LPS)誘導激活后，可產(chǎn)生和釋放大量的iNOS，進而模擬建立不同的炎性疾病模型，包括組織損傷和敗血性休克[22]，以研究殼聚糖及其衍生物的抗氧化應(yīng)激和抗炎癥作用機制。許多研究報道了COS的抗炎性質(zhì)，研究了COS對LPS刺激的小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7細胞的影響，發(fā)現(xiàn)添加COS可引起LPS誘導的TNF-α和IL-6分泌及其mRNA表達呈劑量依賴性降低，COS可以降低LPS誘導的NO分泌，小鼠RAW 264.7細胞培養(yǎng)基中添加COS逆轉(zhuǎn)了TNF-α介導的IL-6和NO含量的降低，從而表明COS的抗炎作用是通過調(diào)節(jié)TNF-α進而降低NO的產(chǎn)生實現(xiàn)的[23]。另有研究表明，經(jīng)預(yù)處理的低分子量硫酸化殼寡糖可抑制因LPS誘導RAW 264.7細胞中NO、IL-6和TNF-α炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，硫酸化殼寡糖可通過核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路活化的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路調(diào)節(jié)抑制LPS誘導的巨噬細胞中IL-6和TNF-α的產(chǎn)生[24]。通過確定虹膜睫狀體(iris ciliary body，ICB)的臨床評分和形態(tài)來評估COS的作用，COS的治療以劑量依賴的方式顯著減輕了ICB的臨床評分，有效降低炎癥介質(zhì)(TNF-α、iNOS等)的表達[25]。殼聚糖被證實可部分抑制肥大細胞中白細胞介素-8(IL-8)和TNF-α的分泌，表明殼聚糖具有降低過敏性炎癥反應(yīng)的潛力，肥大細胞的過敏反應(yīng)中產(chǎn)生的炎性因子涉及許多神經(jīng)炎癥性疾病，殼聚糖及其衍生物可能有助于預(yù)防或減輕其中的一些并發(fā)癥[26]。

有研究表明，不同片段大小的甲殼素可刺激Toll樣受體2(TLR2)、甘露糖受體和炎癥細胞因子的表達，差異性激活NF-κB信號通路和脾臟酪氨酸激酶(spleentyrosine kinase，Syk)，通過多形核白細胞促進吞噬作用產(chǎn)生白細胞介素-1(IL-1)和血小板衍生生長因子，并通過成纖維細胞產(chǎn)生IL-8介導免疫反應(yīng)。研究指出，幾丁質(zhì)具有炎癥調(diào)節(jié)作用，中等大小甲殼素和小甲殼素都能刺激小鼠腹膜巨噬細胞的TNF-α產(chǎn)生，但大甲殼素片段是惰性的[27]。還有研究報道了殼聚糖和季銨化殼聚糖(quaternized chitosan，HTCC)對LPS刺激的人牙周膜細胞中白細胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α產(chǎn)生的影響，殼聚糖抑制了IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生而HTCC增加了IL-1β和TNF-α產(chǎn)生[28]。目前相關(guān)的研究報道甚少，需要進一步探討。

2.2 通過抑制NF-κB信號通路降低NO產(chǎn)生

NO是生物體內(nèi)的一種氣體信號分子和活性氮自由基，介導許多生物功能，如宿主防御、神經(jīng)傳遞、神經(jīng)毒性和血管舒張[29]。NO是由L-精氨酸向L-瓜氨酸轉(zhuǎn)化過程中生成的，并通過一氧化氮合成酶(NOS)內(nèi)源合成，共有3種類型的NOS異構(gòu)體，包括神經(jīng)元一氧化氮合成酶(nNOS)、內(nèi)皮一氧化氮合成酶(eNOS)和iNOS。巨噬細胞來源的NO在生理、病理和炎癥反應(yīng)中起重要作用，活化的巨噬細胞對抗原增殖的抑制作用部分歸因于NO。巨噬細胞在通過分泌NO和促炎細胞因子如TNF-α和IL-6的免疫應(yīng)答中起重要作用，然而NO的過量產(chǎn)生導致各種疾病如動脈粥樣硬化、惡性腫瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、組織損傷和敗血性休克發(fā)生概率的增加[30]。

NF-κB是活化的B細胞與核因子的免疫球蛋白κ輕鏈增強子元件的結(jié)合，具有這種特異性結(jié)合活性的蛋白質(zhì)在大部分細胞中都具有多種調(diào)控功能[31]。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在慢性炎癥中起重要的作用，對參與免疫應(yīng)答反應(yīng)的基因表達的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。除了其在先天免疫中的作用外，NF-κB信號傳導可以控制細胞增殖和凋亡，NF-κB激活通常導致抗凋亡基因的上調(diào)，從而提高細胞存活能力以抵御炎癥反應(yīng)。已經(jīng)證實NF-κB誘導調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的細胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8)，以及黏附分子并導致白細胞募集到炎癥部位[32]。在典型的激活途徑中，興奮性信號可以通過Toll-樣受體(Toll-like receptors，TLR)、IL-1受體、腫瘤壞死因子受體和抗原受體介導，這些受體接收刺激后導致了IκB-激酶復合物的激活，從而活化NF-κB[33]。

在小鼠胰腺β細胞系MIN6中硫酸化殼寡糖(COS-S)對過氧化氫誘導的氧化損傷的保護作用機制的報道中，COS-S顯著抑制了NO產(chǎn)生，同時抑制iNOS的活性及其mRNA表達以及NF-κB蛋白p65的蛋白水平[34]。這些結(jié)果表明，COS-S的抗氧化能力可能與其阻斷了NF-κB信號通路有關(guān)。在小鼠的RAW 264.7細胞氧化應(yīng)激損傷模型中，使用COS可以減少LPS誘導引起的炎癥反應(yīng)，降低了LPS誘導的NF-κB/p65糖基化修飾的水平。這是因為NF-κB糖基化修飾水平的下調(diào)可能有助于NF-κB/p65核移位和降低NF-κB通路的活化，進而下調(diào)了炎性細胞因子的基因表達[35]。有研究表明，酶消化高分子質(zhì)量殼聚糖制備的低分子質(zhì)量殼聚糖寡糖(LM-COS)對體內(nèi)和體外過敏反應(yīng)和過敏性哮喘具有抗炎作用，LM-COS對哮喘模型小鼠中卵清蛋白(OVA)誘導的肺部炎癥具有保護作用，口服LM-COS導致白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-13(IL-13)、TNF-α的mRNA和蛋白水平顯著降低[36]。這表明LM-COS可以消除體內(nèi)哮喘癥狀，這些作用可以由其介導抑制OVA誘導的氣道炎癥期間Th2型細胞因子的表達。此外，NF-κB調(diào)節(jié)促炎細胞因子的表達，LM-COS抑制由免疫球蛋白E(IgE)-抗原復合物刺激的RBL-2H3細胞中NF-κB的活化[37]。

2.3 通過抑制MAPK信號通路降低NO的生成

MAPK通路是促炎癥反應(yīng)中的重要細胞內(nèi)信號傳導通路之一，骨髓分化因子-88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)途徑介導MAPK的活化。MAPK包含3個亞家族：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)、c-jun-氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)和p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)[38]。這些激酶通過降解IκB-α來激活下游的NF-κB調(diào)節(jié)炎癥基因的表達。LPS刺激的巨噬細胞中MyD88和β干擾素TRI結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)依賴性信號通路的激活是通過iNOS表達獲得的[39]。Toll樣受體4(TLR4)是識別LPS并通過2種基本途徑釋放炎癥介質(zhì)的細胞外受體，即MyD88途徑和包含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接子誘導TRIF途徑。研究發(fā)現(xiàn)，COS通過JNK抑制LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞中iNOS的產(chǎn)生[40]。

有研究報道了COS在LPS誘導的仔豬敗血癥中的保護作用，發(fā)現(xiàn)COS不僅減緩了仔豬腸道器官功能障礙，還可以提高LPS注射后的存活率。為了進一步剖析機制，研究了腸道中的嗜中性粒細胞和血清中的TNF-α和IL-1β等幾種促炎癥標志物的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)COS處理的仔豬中這些細胞因子的含量顯著降低；由LPS誘導引起的仔豬敗血癥，其GSH和CAT的消耗增加，且丙二醛含量升高，導致了氧化還原失衡，而COS可逆轉(zhuǎn)這一氧化還原失衡[41]。此外，由LPS激活的信號通路，如JNK和p38，在COS處理后得到緩解，這些結(jié)果表明，COS通過對MAPK信號通路的抑制作用實現(xiàn)其對LPS誘導的小鼠氧化應(yīng)激模型的保護作用[42]。有報道研究了COS對LPS誘導的N9小膠質(zhì)細胞中NO產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COS預(yù)處理可通過抑制活化的小膠質(zhì)細胞中的iNOS表達來抑制NO產(chǎn)生，COS可抑制LPS誘導的p38 MAPK和ERK的磷酸化；COS預(yù)處理也可以抑制NF-κB和激活蛋白-1的活化[43]。這些結(jié)果進一步說明殼聚糖及其衍生物的抗氧化應(yīng)激作用是通過抑制MAPK和NF-κB信號通路的活化，引起iNOS表達下調(diào)，進而抑制NO的生成實現(xiàn)的。

2.4 通過調(diào)節(jié)脂類代謝發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用

低密度脂蛋白(LDL)的氧化與冠狀動脈粥樣硬化有關(guān)。LDL氧化后高水平的膽固醇氧化產(chǎn)物對內(nèi)皮細胞有毒性[44]。巨噬細胞在炎癥反應(yīng)中的保護作用主要通過清除免疫調(diào)節(jié)因子如TNF-α和IL-1等刺激因子促進了LDL與內(nèi)皮細胞、平滑肌的結(jié)合。抗氧化劑通過抑制單核細胞黏附分子的上調(diào)，增強人體中LDL的抗氧化能力，從而發(fā)揮免疫作用。高密度脂蛋白可以抑制由細胞因子誘導的內(nèi)皮細胞黏附分子的表達[45]。許多資料報道了殼聚糖具有降低膽固醇含量的效應(yīng)，研究表明，殼聚糖及其衍生物對血清中甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量的降低有著顯著作用[46]。有報道證實，飼喂小鼠12周γ射線照射的殼聚糖，其體內(nèi)總膽固醇含量顯著低于對照組[47]。攝入低分子質(zhì)量的殼聚糖可以抑制血液透析患者中常見的血清白蛋白的氧化，進而降低與尿毒癥相關(guān)的氧化應(yīng)激。此外，羧化殼寡糖能夠抑制細胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的自由基介導的氧化，同時降低小鼠巨噬細胞中脂質(zhì)氫過氧化物的水平和羰基碳含量，從而發(fā)揮其抗氧化作用。

3 小 結(jié)

綜上所述，殼聚糖及其衍生物主要通過抑制NF-κB和MAPK信號通路降低NO的生成，調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫因子發(fā)揮其抗氧化及抗炎性功能，也可通過調(diào)節(jié)脂類代謝發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的功能。

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