李 銘，鄒 穎，郭 寒，常仁旭，葛婧昕，楊 威，陳媛媛，夏 成，張洪友，張冰冰，徐 闖*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶 163319)

內(nèi)質網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)廣泛存在于除哺乳動物成熟紅細胞以外的各種真核細胞中，屬于真核細胞中精細的膜系統(tǒng)。內(nèi)質網(wǎng)膜系統(tǒng)是細胞加工蛋白質、脂質及貯存鈣離子的主要場所，是分泌途徑的第一步。對于大多數(shù)分泌和跨膜蛋白來說，其新翻譯的未經(jīng)折疊的蛋白經(jīng)過富有鈣離子與折疊酶環(huán)境的內(nèi)質網(wǎng)進行初步的加工形成穩(wěn)定的三級結構，且蛋白質在內(nèi)質網(wǎng)腔中只有被正確的構象與修飾，才能轉運至高爾基體內(nèi)進一步加工[1]。而錯誤折疊的蛋白質在內(nèi)質網(wǎng)中則被相應的蛋白解體酶降解。Ca2+參與細胞內(nèi)許多重要生理過程，如轉錄因子的激活、細胞質增殖與凋亡、蛋白質的修飾等。Ca2+的儲存和信號傳導是內(nèi)質網(wǎng)重要功能之一。Ca2+在體內(nèi)的濃度受到非常嚴密的調控時，機體才能處于較穩(wěn)定的狀態(tài)；當Ca2+濃度紊亂，機體則會發(fā)生很多不利反應。細胞內(nèi)外Ca2+濃度梯度差異是Ca2+作為胞內(nèi)第二信使的前提和重要條件。而這種情況主要是由內(nèi)質網(wǎng)Ca2+-ATP酶泵(sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCAs)產(chǎn)生的。內(nèi)質網(wǎng)還在脂質生物合成中起核心作用并產(chǎn)生磷脂、膽固醇、三酰甘油和神經(jīng)酰胺等。膽固醇合成的限速酶在內(nèi)質網(wǎng)膜上。當膽固醇水平下降時，內(nèi)質網(wǎng)中的固醇調節(jié)元件結合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)被激活，從而上調膽固醇表達，硬脂酰輔酶A脫氫酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)催化飽和游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)去飽和[1]。絲氨酸棕櫚酰轉移酶，即從頭合成神經(jīng)酰胺的限速酶，也位于內(nèi)質網(wǎng)膜上。

1 內(nèi)質網(wǎng)應激

內(nèi)質網(wǎng)功能的正常發(fā)揮是細胞存活的必要條件。不論是正常的生理變化還是對環(huán)境的適應表現(xiàn)，蛋白質表達量的變化大都是通過內(nèi)質網(wǎng)的調節(jié)來實現(xiàn)的[2]。由于游離膽固醇與磷脂比率和飽和游離脂肪酸含量較低，因此內(nèi)質網(wǎng)膜是細胞膜中最流動的膜之一[3]。由于內(nèi)質網(wǎng)膜有序性的增加而引起膜流動性的損失，導致Ca2+消耗和蛋白質錯誤折疊。在缺氧、藥物作用、自由基侵入、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等刺激下，內(nèi)質網(wǎng)的正常功能被打亂，大量蛋白質被錯誤的折疊，導致大量未折疊蛋白質(unfolded protein，UP)堆積在內(nèi)質網(wǎng)中，促使內(nèi)質網(wǎng)啟動應急機制來緩解未折疊蛋白產(chǎn)生的壓力，這個過程稱為內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[4]。內(nèi)質網(wǎng)應激是一種重要的細胞自我防御機制，內(nèi)質網(wǎng)應激時最先啟動生存途徑，但長時間的內(nèi)質網(wǎng)應激將導致細胞啟動凋亡途徑[5]。內(nèi)質網(wǎng)應激也是一種病理機制，如突變體表達蛋白質紊亂，內(nèi)質網(wǎng)伴侶水平或Ca2+含量不足，氧化還原或ATP狀態(tài)改變，內(nèi)質網(wǎng)磷脂消耗和膽固醇積累。內(nèi)質網(wǎng)應激與帕金森病、骨質疏松癥、癌癥、退行性神經(jīng)疾病均相關。此外，肝細胞中含有大量的內(nèi)質網(wǎng)，許多肝臟疾病均與內(nèi)質網(wǎng)應激及其介導的細胞凋亡相關，如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、藥物性肝病、急性肝衰竭、肝癌等[6]。內(nèi)質網(wǎng)應激是由未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)、內(nèi)質網(wǎng)相關性凋亡和整合應激反應這3種反應相互關聯(lián)的動態(tài)過程，主要為未折疊蛋白反應[7]。UPR的主要目的是減少未折疊的蛋白質負荷并恢復細胞器的穩(wěn)態(tài)。為此，UPR減少蛋白質翻譯并誘導參與折疊、N-糖基化、內(nèi)質網(wǎng)相關降解、質量控制、氧化還原及脂質生物發(fā)生的內(nèi)質網(wǎng)中的轉錄等。

內(nèi)質網(wǎng)膜上存在著3種內(nèi)質網(wǎng)跨膜受體感應蛋白分別是肌醇依賴酶1(inositol requiring enzyme1,IRE1)、RNA激活蛋白激酶的內(nèi)質網(wǎng)類似激酶(pancreatic elf-2 kinase pancreatic ER kinase，PERK)和激活轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)[8]。IRE1α具有蛋白激酶活性和位點特異性內(nèi)切核糖核酸酶(RNase)活性。PERK還具有蛋白激酶活性并起到磷酸化真核翻譯起始因子2α(eukaryotic Initiation Factor 2α，eIF2α)的α亞基作用。ATF6是屬于cAMP應答元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)和ATF家族轉錄因子的堿性亮氨酸拉鏈(basic region/leucine zipper motif，bZIP)-結構域轉錄因子。在靜息細胞中，ERS受體通過與ER分子伴侶GRP78/Bip結合而處于未激活狀態(tài)，一旦大量的未折疊蛋白聚集，GRP78/Bip便與這3個受體解離，去結合異常的蛋白。且膜受體蛋白解離后發(fā)生專屬激活通路，IRE1與PERK發(fā)生二聚化與自身磷酸化，當ATF6從內(nèi)質網(wǎng)膜轉運至高爾基體后經(jīng)過特異蛋白酶裂解形成激活的ATF6，從而觸發(fā)UPR。

當PERK從Bip釋放后，對ERS最直接的反應是PERK的同型二聚化和反式磷酸化，同時PERK磷酸化eIF2α。eIF2α的磷酸化抑制80 S核糖體的組裝，并因此抑制蛋白質的合成。該途徑通過阻止額外新生多肽進入已經(jīng)飽和的ER腔而促進細胞存活。同時IRE1α發(fā)生自磷酸化，從而激活其核糖核酸酶活性。然后從編碼X盒結合蛋白1(X box bindging protein1，XBP1)的mRNA開始除去26堿基內(nèi)含子，使XBP1具有作為轉錄因子的有效活性[9]。

當ATF6從BiP釋放時，它轉移到高爾基體中被第1位點蛋白酶(site-1 protease，S1P)和第2位點蛋白酶(site-2 protease，S2P)切割。該過程導致ATF6的功能性(含bZIP)片段釋放到胞質中。這個片段然后遷移到核并激活轉錄[10]。值得注意的是，S1P和S2P還能切割膽固醇和脂肪酸生物合成所需的ER相關甾醇調節(jié)元件結合蛋白[10]。切割的ATF6和活性XBP1亞型功能相似，以誘導編碼ER伴侶蛋白和促進蛋白質折疊、成熟、分泌及ER相關蛋白降解酶基因的轉錄。然而，如果細胞不能解決蛋白質折疊缺陷并恢復內(nèi)質網(wǎng)中的穩(wěn)態(tài)，則UPR將啟動凋亡，通過去除產(chǎn)生錯誤折疊或功能障礙蛋白質的應激細胞來保護機體[11]。

ERS誘導的細胞凋亡主要由C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)介導，但是CHOP誘導細胞凋亡的機制仍然不清楚。然而，已經(jīng)顯示CHOP誘導促進應激細胞中的蛋白質合成和氧化應激的許多促凋亡因子(如TRB3，BIM和GADD34)的表達[12-13]。

2 內(nèi)質網(wǎng)中鈣離子的作用

Ca2+的動態(tài)平衡是細胞保持正常結構和功能的前提與基礎。內(nèi)質網(wǎng)是細胞內(nèi)的重要鈣庫，通過維持細胞內(nèi)外Ca2+濃度的平衡來調控內(nèi)質網(wǎng)功能、膜轉運及保持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)態(tài)。細胞內(nèi)Ca2+水平是由鈣庫內(nèi)質網(wǎng)釋放介導的。Ca2+作為細胞內(nèi)重要的第2信使分子，參與了細胞增殖、分化、運動、肌肉收縮、激素的分泌糖原代謝及神經(jīng)元興奮性等生理活動，進而調節(jié)基因和蛋白的表達、分泌、代謝和凋亡[14]。雖然目前對細胞凋亡有很多機制尚不明確，但是研究顯示當內(nèi)質網(wǎng)中Ca2+穩(wěn)態(tài)遭受破壞時，可以啟動細胞早期凋亡信號。在靜息狀態(tài)下內(nèi)質網(wǎng)中的Ca2+濃度高于細胞質中Ca2+濃度，藍尼啶受體(ryanodinereceptor，RyR)、1，4，5-三磷酸肌醇受體(inositol-1，4，5-triphosphatereceptor，IP3R)和鈣泵3種位于內(nèi)質網(wǎng)上與Ca2+的釋放和攝取密切相關的通道是內(nèi)質網(wǎng)維持Ca2+穩(wěn)態(tài)的主要因素，對于維持細胞內(nèi)Ca2+動態(tài)平衡有著重要的作用[15]。在生理狀態(tài)下，內(nèi)質網(wǎng)中的Ca2+大部分呈游離狀態(tài)，由RyR和IP3R兩種受體負責將Ca2+從內(nèi)質網(wǎng)腔中釋放到細胞質內(nèi)，然后鈣泵又將胞質中的Ca2+攝取回到內(nèi)質網(wǎng)中，該過程持續(xù)進行，使Ca2+保持著動態(tài)平衡[15]。游離的Ca2+在內(nèi)質網(wǎng)中具有較高的作用，它的變化幾乎關系到細胞內(nèi)所有的反應，小到細胞收縮、胞吐，大到基因、蛋白表達和細胞死亡。當大量Ca2+從內(nèi)質網(wǎng)中釋放出來后可以激活鈣調蛋白分解酶、死亡相關蛋白激酶，最終可以導致細胞發(fā)生凋亡。

3 鈣池引發(fā)鈣離子的內(nèi)流

細胞內(nèi)主要儲存Ca2+的細胞器為內(nèi)質網(wǎng)，濃度約為400 μmol/L[16]。參與Ca2+濃度調控的通道蛋白主要有兩種功能：①誘導細胞外鈣離子進入細胞內(nèi);②誘導細胞內(nèi)Ca2+的釋放[17]。而胞內(nèi)鈣池引發(fā)鈣離子內(nèi)流(store-operated Ca2+entry，SOCE)廣泛存在于興奮細胞與非興奮細胞之間，是細胞攝取外源Ca2+的主要方式之一，相對的在非興奮細胞中起著更重要的作用。Ca2+通透性受體調節(jié)通道(ROCs)和鈣池引發(fā)的鈣離子進入(SOCE)是調控其細胞內(nèi)鈣離子濃度Ca2+的主要通道。目前認為ROCs引起的Ca2+升高是一個瞬時變化，不足以維持細胞的長期反應，SOCE則可持續(xù)升高Ca2+，而Ca2+持續(xù)升高是胞內(nèi)多種激酶激活的必要條件[18]。SOCE被內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)腔Ca2+濃度降低激活而開放，生理作用在于補充內(nèi)質網(wǎng)的Ca2+而避免鈣庫Ca2+耗竭。間質相互作用因子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)和鈣釋放激活鈣通道蛋白1(calcium release-activated calci-umchannel protein 1，Orai1)是目前已確定的SOCE組成蛋白，STIM1為內(nèi)質網(wǎng)上Ca2+濃度感受器，Orai1是SOCE在細胞膜上的孔蛋白[19]。當內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)鈣池消耗后，STIM蛋白偶聯(lián)并活化Orai蛋白，SOCE通路開放形成內(nèi)向的Ca2+流以補充消耗的Ca2+。這對于維持細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)起著至關重要的作用，也保證了細胞內(nèi)Ca2+傳遞的準確性。

STIM蛋白是存在于內(nèi)質網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，目前研究發(fā)現(xiàn)其存在STIM1和STIM2蛋白2種亞型，其在氨基酸序列上存在著高度的同源性[20]。STIM1和STIM2蛋白在細胞之中存在著通過與Orai蛋白競爭性結合來發(fā)揮其各自的功能的競爭關系。研究顯示在大多數(shù)細胞中，STIM1蛋白的表達量高于STIM2蛋白，且STIM2蛋白與STIM1蛋白相比較對Orai蛋白的激活能力較弱[21-22]。因此STIM1蛋白在Ca2+的信號轉導中起著重要的作用。STIM1蛋白N端含有EF手性結構域和SAM(sterile α- motif)結構域組成的區(qū)域能夠感受內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)鈣池Ca2+濃度的微小變化并引發(fā)分子間的相互作用[23]。STIM1蛋白C端結構域能夠跨過內(nèi)質網(wǎng)和細胞膜。也包含具有活化功能的SOAR(STIM-Orai activating region)結構域，該結構域可介導Orai蛋白與STIM1蛋白結合使SOCE通路開放[24]。靜息狀態(tài)下，STIM蛋白可能以二聚體的形式廣泛分散在整個內(nèi)質網(wǎng)中。在鈣池消耗后數(shù)秒內(nèi)，STIM1蛋白快速聚合化并移動至內(nèi)質網(wǎng)近細胞膜區(qū)以結合并活化Orai蛋白。

Orai蛋白廣泛表達于多種細胞中。在哺乳動物中，它有3種同源蛋白Orai1、Orai2及Orai3，3種蛋白的一級結構非常相似，是一個定位于細胞膜的4次跨膜蛋白，且其N端和C端均位于胞漿一側。靜息狀態(tài)下Orai蛋白多以二聚體的形式存在于細胞膜表上，當鈣池耗竭時，由于STIM1蛋白的激活使得Orai1由二聚體聚合為四聚體形成CRAC通道。Orai1、Orai2和Orai3都有mRNA表達，3種Orai以同源二聚體、同源多聚體、異源多聚體形式存在于細胞膜上[25]。研究發(fā)現(xiàn)，當Orai2蛋白和Orai3蛋白與STIM1共同表達時均能形成Ca2+通道并且顯示出類似于Orai1與STIM1的共表達產(chǎn)生的Ca2+釋放激活的鈣電流(calcium release-activated calcium current，ICRAC)的電生理特性[26]。所有Orai蛋白均可增加SOCE，Orai增強SOC的作用由高至底依次為Orai1、Orai2、Orai3，其中Orai3能補償Orai1缺乏時的功能[27]；STIM1并不進入細胞膜中，而是在距離細胞膜約10 nm～25 nm范圍內(nèi)與Orai蛋白相互作用。

SOCE的過程具體步驟為：細胞在靜息狀態(tài)下，STIM1蛋白在均勻的分布在內(nèi)質網(wǎng)膜表面，STIM1蛋白位于內(nèi)質網(wǎng)中的cEF手性結構域結合充足的Ca2+形成穩(wěn)定的結構域[28]。當內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)的Ca2+濃度較低時Ca2+從cEF手性結構域中解離引起穩(wěn)定的結構域的展開從而使STIM1蛋白構象變化并發(fā)生多聚化，并激活Orai1蛋白，引發(fā)鈣內(nèi)流從而補充鈣池，當鈣池內(nèi)的Ca2+濃度恢復后STIM1蛋白迅速的與Orai1蛋白分離，Orai1通道也相應的關閉。

4 展望

鈣離子是重要的細胞內(nèi)第二信使，參與細胞的多種生理病理過程，肝細胞在生理濃度的激素作用下可引起Ca2+持續(xù)升高，在生理狀態(tài)下，鈣離子信號調節(jié)肝細胞的多種生理功能。研究表明，內(nèi)質網(wǎng)應激及其介導的細胞凋亡與肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關，對內(nèi)質網(wǎng)應激作用機理的研究，既可以進一步了解細胞在應激狀態(tài)下的自我調控能力，還可以進一步了解肝病的發(fā)生機制，從而對疾病采取一些新的干預、治療措施，達到預防和治療疾病的目的。如通過應用一些細胞毒性藥物誘發(fā)Ca2+升高導致內(nèi)質網(wǎng)應激，加速癌細胞的凋亡來治療癌癥，也可以應用一些藥物或者細胞因子來阻斷疾病，減少甚至逆轉細胞的凋亡，達到保護作用，但是Ca2+誘導的內(nèi)質網(wǎng)應激引起的細胞損傷在疾病中扮演了多大的作用尚不清楚，干擾藥物的研究也僅僅處于起步階段，有關Ca2+誘導的內(nèi)質網(wǎng)應激的作用需要更多的研究予以證實。