周廣舟，孫彥鶴，郭爽爽

(河南工業(yè)大學生物工程學院，河南鄭州 450001)

現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在過去的30年中取得了巨大發(fā)展，并成為世界范圍內(nèi)主要的經(jīng)濟和農(nóng)業(yè)增產(chǎn)途徑之一，但近來細菌、真菌、病毒和其他病原侵染引起的大量水生動物性疫病嚴重制約著該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而且每年還不斷有新的病原體出現(xiàn)[1]。對病毒性病原體來說，鑒于其主要隱藏在宿主細胞內(nèi)并利用細胞代謝系統(tǒng)進行復制和擴散，開發(fā)能正常干擾病毒復制而又不影響宿主細胞結(jié)構(gòu)和功能的抑制或治療措施尚無成功，致使水生動物病毒性疾病的暴發(fā)成為目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨的難解課題之一[2]。目前，世界各地不同研究小組已從養(yǎng)殖或野生水生動物體內(nèi)尋找并鑒定出包括虹彩病毒、呼腸病毒、水生雙RNA病毒等多種病毒，并證明它們是多類水生動物傳染性疫病的主要病原和引起水產(chǎn)動物產(chǎn)量和價值降低的主要元兇[3]。

細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)大多是細胞在遇到內(nèi)外環(huán)境因素刺激后而采取的一種主動的受基因調(diào)控啟動的有序死亡方式，涉及到多種細胞因子和調(diào)控機制，常見的有細胞凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)等[4]。宿主細胞可以利用凋亡和自噬過程限制入侵病毒的擴增和傳播[5]，反過來病毒也可能在該過程中產(chǎn)生更多的子代病毒或利于自身的釋放[6]。除此之外，近年來還有在病毒感染過程中有新的細胞程序性非典型死亡方式如細胞壞死性凋亡(necroptosis)、焦亡(pyroptosis)等的報道[7-8]，都提示病毒與宿主細胞之間的關(guān)系是復雜而多樣的。在水生動物病毒學研究領(lǐng)域，也有多科病毒在感染細胞過程中誘導細胞凋亡并發(fā)揮特定功能的報道[9]。近幾年還有一些魚類病毒如鯉春彈狀病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)、虹彩病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)等誘導細胞自噬的研究報道[10-11]。這些研究實踐為未來深入探討水生動物病毒的致病機制和開發(fā)可能的防控措施提供了理論基礎(chǔ)。本文就水生動物病毒感染后誘導的細胞程序性死亡機制研究進展進行綜述，以期為今后水生動物病毒與宿主細胞的關(guān)系研究積累更多資料。

1 水生動物病毒誘導的細胞凋亡研究

作為一種常見的用來清除非必需或受損細胞器且受到高度調(diào)控的細胞程序性機制，凋亡在維持機體細胞正常發(fā)育、動態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用[12]。常見的凋亡路徑包括外源性(死亡受體)和內(nèi)源性(線粒體)通路兩種，往往都涉及到多種半胱氨酸蛋白酶的激活和切割。在近年來對水生動物病毒的研究中，發(fā)現(xiàn)多科病毒具有誘導細胞凋亡的能力，并在特定細胞內(nèi)執(zhí)行不同的功能。

1.1 Bad介導的細胞死亡途徑——水生雙RNA病毒(Aquabirnavirus)

研究最廣泛和深入的魚類病毒之一——傳染性胰腺壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)即是該病毒屬的重要成員。盡管在20世紀40年代就在養(yǎng)殖鱒魚中發(fā)現(xiàn)了相關(guān)疫病，但直到1955年前后才最終根據(jù)其感染組織病理變化進行了定名。IPNV宿主范圍廣泛能感染多種魚類，并引起不同程度的侵染病癥，帶來巨大的經(jīng)濟損失。

研究發(fā)現(xiàn)，IPNV在感染魚類細胞CHSE-214后6 h即能檢測到典型的凋亡形態(tài)變化，細胞逐漸變圓并進入凋亡程序，8 h后已有超過60%受染細胞出現(xiàn)DNA片段化現(xiàn)象[13]。進一步的研究顯示，IPNV感染時能激活凋亡前體蛋白Bad基因表達，下調(diào)Mcl-1因子。在斑馬魚細胞系ZLE中單獨過表達IPNV的結(jié)構(gòu)蛋白基因VP3后也能導致Bad基因上調(diào)，進而引起線粒體膜電位降低，激活起始和效應(yīng)caspases，最終引起細胞死亡[14]。這表明IPNV可以通過其蛋白誘導細胞凋亡。

最近有關(guān)IPNV的研究顯示，IPNV在感染后其幾個蛋白基因?qū)Υ笪餮篚qI型干擾素具有顯著的拮抗效應(yīng)，其中VP2、VP3、VP4和VP5拮抗IFNa1啟動子活性，而VP1卻能誘導IFNa1的產(chǎn)生[15]。這種凋亡晚期標志現(xiàn)象提示作為一種應(yīng)對IPNV復制的防御機制，細胞凋亡能有效導致細胞死亡從而不會長時間維持病毒的復制循環(huán)，進而減少子代病毒的產(chǎn)生。但實際上在感染的CHSE-214細胞中仍會產(chǎn)生高滴度的IPNV，表明有部分細胞能逃避凋亡并維持病理狀態(tài)從而導致生成更多的子代病毒粒子。上述結(jié)果體現(xiàn)了IPNV感染細胞后的復雜性。

1.2 線粒體介導的細胞死亡通路——乙型野田村病毒(Betanodavirus)

該病毒屬的代表株——神經(jīng)壞死癥病毒(Nervous necrosis virus,NNV)是一種RNA病毒，主要侵染魚類腦、視網(wǎng)膜和脊髓等部位，對仔(幼)魚的致死率可達95%，能感染至少40余種海水和淡水魚類，并不斷有新的宿主范圍報道[16]。

研究表明，該科病毒主要是通過線粒體介導的細胞死亡方式誘導細胞死亡。如赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒(Red spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)感染細胞后在早期復制階段(24 h內(nèi))誘導線粒體ROS產(chǎn)生，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[17]。在感染的早中期，胞內(nèi)線粒體膜電位(MMP)下調(diào)，而特異性抑制劑BKA可以阻止其下調(diào)和細胞色素c的釋放。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RGNNV感染能引起細胞抗凋亡蛋白基因Bcl-2表達下調(diào)，反過來Bcl-2家族成員zfBcl-xL和zfMcl-1a均能較強的抑制RGNNV引起的細胞壞死，抑制率分別達到90%和93%[18]。但RGNNV感染的多個caspases酶活包括caspases-3，8，9等與對照組相比并無明顯差別，廣譜性caspases抑制劑處理也對病毒誘導的細胞死亡沒有顯著影響[18]。這些結(jié)果都提示，乙型野田村病毒能在不同細胞系分別激活caspase依賴和非依賴的兩種細胞死亡途徑。其中RGNNV主要激活caspase非依賴的死亡通路，而如巨石斑魚神經(jīng)壞死病毒(Greasy grouper nervous necrosis virus,GGNNV)等在海鱸細胞里能引起caspase依賴的細胞死亡[19]。

1.3 p38 MAPK/ROS介導的細胞死亡途徑——正粘病毒(Orthomyxovirus)

傳染性鮭魚貧血病病毒(Infectious salmon anemia virus,ISAV)即是該病毒屬的主要代表，其基因組由八個單股負義RNA分子構(gòu)成，至少編碼10個病毒蛋白，主要侵染大西洋鮭魚，引起魚體貧血、腹水、內(nèi)臟器官和皮膚等點狀出血，可導致受染魚急性病變或處于長期帶毒狀態(tài)。

最近的研究顯示，ISAV感染S.salar白細胞后能激發(fā)氧自由基的產(chǎn)生，并通過p38 MAPK信號通路介導凋亡前體蛋白的激活和表達并最終引起細胞凋亡。Olavarría V H等[20]在ISAV感染的鮭魚細胞系SHK-1內(nèi)，利用抑制劑SB203580阻斷caspase-3酶活后發(fā)現(xiàn)，病毒激活的p38 MAPK仍能導致細胞出現(xiàn)凋亡。用夾竹桃麻素(apocynin)處理抑制NADPH氧化酶活性后，caspase-3活性與未感染組相當。但在感染72 h后，病毒滴度有16%的降低，表明細胞超氧陰離子的水平影響病毒粒子的成熟。但由于Apocynin只阻斷NADPH氧化酶而不干擾p38 MAPK的活性，對ISAV感染引起的p38 MAPK和NAPDH氧化酶激活之間的關(guān)系仍然未知，后續(xù)需要繼續(xù)開展ISAV感染的細胞和分子生物學機制研究。

1.4 ROS介導的細胞死亡途徑——水生呼腸病毒(Aquareovirus)

水生呼腸病毒為無包膜病毒，基因組通常由11個節(jié)段的線性雙股RNA構(gòu)成，草魚呼腸病毒(Grass carp reovirus,GCRV)作為其中致病力最強的毒株之一[21]，是引起草魚出血病的主要病原。近年來在草魚腎臟細胞系CIK的感染試驗表明，GCRV能誘導細胞凋亡和胞內(nèi)氧化損傷[22]。在感染早期(24 h前)，胞內(nèi)TNF-α釋放進而激活caspase-8和下游的caspases酶(如caspase-3等)，導致細胞典型的內(nèi)源性和外源性凋亡的發(fā)生。但需注意的是，caspases酶的激活不依賴于病毒的復制，而且感染72 h后可能由于細胞的大量死亡，caspase 3、8、9酶活還會下降。以上結(jié)果提示，GCRV感染早期誘導細胞凋亡，而細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生在感染后期(72 h～96 h)，且后者影響病毒的復制循環(huán)。事實上，氧化應(yīng)激(主要是ROS和RNS的產(chǎn)生)是很多病毒感染的特征[23]，所以GCRV感染采用這樣的策略導致宿主細胞的死亡機制也并不鮮見。

1.5 ERK細胞死亡途徑——蛙虹彩病毒(Ranavirus)

虹彩病毒科成員是一類大DNA病毒，能感染包括甲殼類、貝類、昆蟲、魚類、兩棲類和爬行類生物，具有廣泛的宿主范圍并對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[24]。該科病毒目前分成5個屬，誘導細胞死亡機制復雜，其中的信號通路機制仍有很多未知。

大口鱸魚病毒(Largemouth bass virus,LMBV)是一種屬于虹彩病毒蛙病毒屬(Ranavirus)的成員，Huang X等[25]對其研究發(fā)現(xiàn)，LMBV能誘導具典型內(nèi)源和外源性特征的細胞凋亡，包括出現(xiàn)凋亡小體、caspases酶激活和細胞色素c釋放等。此外還發(fā)現(xiàn)，PI3K和ERK細胞信號通路不僅參與到病毒自身的復制過程中，還跟病毒誘導的細胞凋亡有關(guān)。用LY294002抑制劑阻斷PI3K信號通路后，病毒滴度會嚴重降低，同時細胞凋亡程度加劇，表明PI3K通路對LMBV的感染是必需的。而抑制劑U0126抑制ERK信號通路后雖能降低子代病毒的產(chǎn)量，但病毒誘導的細胞自噬也被抑制，這與另一種蛙病毒屬成員——新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)感染細胞后激活的ERK信號通路的作用類似[26]，提示ERK信號通路可能是一個潛在的抗虹彩病毒分子靶點。但需注意的是，LMBV感染后，細胞的p53、AP-1、NF-κB和CREB等因子的啟動子活性均顯著降低，這與其他蛙虹彩病毒的不同。

1.6 Fas介導的細胞死亡途徑——細胞腫大虹彩病毒(Megalocytivirus)

條石鯛虹彩病毒(Rock bream iridovirus,RBIV)是虹彩病毒科的另一個病毒屬——腫大細胞病毒屬成員，感染魚體后能引起脾腫大和各內(nèi)臟器官嗜堿性細胞的增多。目前，盡管對條石鯛應(yīng)對RBIV的抗病毒免疫機制尚未明晰，但RBIV侵染過程中細胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子如穿孔素、顆粒酶、Fas配體和caspases酶等已在不同宿主內(nèi)得到鑒定。學者們對RBIV在不同致病力條件下感染條石鯛后細胞凋亡相關(guān)因子進行了研究，并發(fā)現(xiàn)了Fas介導參與的細胞死亡信號通路。

研究發(fā)現(xiàn)，RBIV感染后若魚體放置到26℃水溫條件下，致死率往往能達到100%。而如果感染后放置在23℃ 1周后移至17℃水溫條件下，致死率僅能達到18%(30 d后)[27]。在高致病組，檢測發(fā)現(xiàn)魚體的穿孔素、顆粒酶、Fas配體和caspase-9表達量在感染8 d時都呈顯著上調(diào)，而凋亡抑制因子1(IAP1)僅在感染第1天和第4天時呈高表達，第8天和第10天的表達量與對照組沒有明顯差別。而在低致病組，試驗魚體內(nèi)穿孔素、顆粒酶和Fas配體的表達量直到感染30 d后仍顯著高于對照組，F(xiàn)as和caspase-8，9，3表達沒有統(tǒng)計學顯著差異。低致病組試驗魚體內(nèi)IAP1的表達量也比對照組的要高(第10天、第20天和第22天)。IAP1的上調(diào)抑制了RBIV感染后的凋亡反應(yīng)，但目前仍不清楚這種抑制效應(yīng)對魚類生存是否有利。另外，F(xiàn)as及其配體和caspase-8等雖短時間內(nèi)維持高表達，但不足以激活下游的凋亡分子。后續(xù)更深入地從分子水平研究病毒蛋白和宿主凋亡調(diào)節(jié)因子可為揭示RBIV的侵染機制提供更多信息。

2 水生動物病毒誘導的細胞非典型凋亡研究

新加坡石斑魚虹彩病毒株SGIV感染石斑魚宿主細胞EAGS后并未呈現(xiàn)典型的細胞凋亡特征，僅表現(xiàn)一種稱為類凋亡的細胞死亡方式，表現(xiàn)為胞質(zhì)空泡化、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、caspases酶活缺陷等，但無經(jīng)典的凋亡小體形成和DNA片段化等特征出現(xiàn)[26]。當用SGIV感染非宿主細胞——胖頭鱥肌肉細胞系FHM后，細胞出現(xiàn)典型的凋亡特征。此外還發(fā)現(xiàn)，SGIV感染EAGS細胞早期，細胞ERK1/2磷酸化，病毒可以利用激活的ERK信號途徑逃避宿主IFN誘導的抗病毒免疫反應(yīng)，進而利于自身的復制和傳播。用抑制劑U0126抑制ERK信號通路延遲了細胞病變的發(fā)生，降低了SGIV誘導的非凋亡型細胞死亡和病毒復制量。上述這些數(shù)據(jù)表明，ERK信號途徑參與了SGIV病毒的感染和細胞非凋亡型死亡過程。

3 魚類病毒誘導的細胞自噬研究

在水生動物病毒學領(lǐng)域有關(guān)病毒感染細胞引起自噬及后續(xù)效應(yīng)的研究盡管不多，但最近幾年還是有了一定的發(fā)展[28]，學者們對幾株魚類病毒誘導的自噬對細胞的生存和病毒的復制以及二者之間的相互關(guān)系進行了深入地探索。

3.1 魚類彈狀病毒SVCV誘導的細胞自噬

目前對魚類彈狀病毒誘導細胞自噬的研究相對于其他科病毒的研究要深入得多，主要是基于對哺乳動物彈狀病毒的前期理解基礎(chǔ)上開展的工作。哺乳動物彈狀病毒，如水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)，感染果蠅后首先能誘導細胞出現(xiàn)抗病毒自噬免疫反應(yīng)[29]，自噬小體數(shù)量增多，自噬相關(guān)基因(如LC3-II、Atg8等)表達上調(diào)，自噬蛋白的表達會提高子代病毒的復制量。滅活的病毒粒子或單獨的病毒糖蛋白(glycoprotein)也能激活自噬反應(yīng)，已經(jīng)確認VSV G蛋白可作為一種病原相關(guān)分子模式被果蠅細胞受體Toll-7識別并啟動抗病毒自噬保護反應(yīng)[30]，表明VSV誘導的細胞自噬對病毒的復制不是必須的。

近年來，對魚類彈狀病毒的代表株——鯉春彈狀病毒SVCV的研究顯示，其G蛋白啟動細胞的自噬效應(yīng)對病毒自身的基因組RNA復制和子代復制卻是必須的[10]，且在病毒感染過程中有助于清除受損的線粒體DNA從而維持細胞生存。由于自噬具有細胞特異性，不同細胞自噬的分子機制不同，且即使是同一種細胞，自噬的調(diào)控機制也可能不同[31]。上述不同研究組使用的細胞系不同，可能是導致彈狀病毒感染不同細胞后自噬效應(yīng)不一的原因。Wang等[32]對鱧魚水皰病毒(Snakehead fish vesiculovirus,SHVV)感染鱧魚細胞系SSN-1的研究也檢測到明顯的自噬性信號，而且發(fā)現(xiàn)誘發(fā)的細胞自噬能抑制病毒的復制。這些結(jié)果都為未來開展更深入的魚類病毒與宿主細胞相互作用關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

3.2 傳染性鮭魚貧血病毒誘導的細胞自噬

傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)作為正黏病毒科的一員，近年發(fā)現(xiàn)其感染魚類細胞后細胞出現(xiàn)典型的自噬特征，包括雙層膜樣自噬小體和LC3蛋白的點狀聚集(熒光顯微鏡觀察)等[33]。自噬抑制劑3-MA處理能減少重組表達質(zhì)粒LC3-GFP在胞內(nèi)的聚集，且能降低病毒載量，顯示自噬過程可能在子代病毒復制循環(huán)中發(fā)揮一定的作用。

3.3 魚類虹彩病毒(Fish iridovirus)誘導的細胞自噬

虹彩病毒誘導的細胞自噬近年有了新的進展，Qi H等[34]對5株不同脊椎動物虹彩病毒感染鱖魚魚苗細胞系MFF-1誘導細胞自噬的狀況進行分析的結(jié)果表明，石斑魚虹彩病毒(Grouper iridovirus,GIV)和大口鱸魚虹彩病毒LMBV感染后能誘導細胞出現(xiàn)自噬小體，但在傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)、中國大鯢虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)和虎紋蛙病毒(Tiger frog virus,TFV)感染的細胞內(nèi)未顯現(xiàn)類似現(xiàn)象。免疫印跡分析能檢測到LC3蛋白的轉(zhuǎn)換，熒光顯微鏡觀察能檢測到LC3蛋白的點狀聚集，后續(xù)藥物測試顯示自噬主要在GIV和LMBV的感染細胞內(nèi)起抗病毒作用，提示未來可能開發(fā)基于自噬調(diào)節(jié)的抗虹彩病毒感染新措施。

有趣的是，Li C等[11]利用ISKNV在鮭魚腦細胞系CPB的感染試驗中發(fā)現(xiàn)，ISKNV能誘導細胞出現(xiàn)完整的自噬流，呈現(xiàn)典型的LC3蛋白轉(zhuǎn)換及點狀聚集和大量自噬小泡等特征。藥物處理細胞后分析發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素誘導的細胞自噬有助于ISKNV復制和蛋白合成，但不利于胞外病毒產(chǎn)量的增加。相反，自噬抑制劑氯喹(CQ)處理能提高ISKNV感染細胞上清液的病毒滴度。這些結(jié)果與Qi H等[34]利用ISKNV感染MFF-1細胞的狀況完全不同，這可能與使用不同的細胞系有關(guān)，進而導致是否誘導自噬存在差異。

4 展望

在過去的幾十年間，人們已從人工養(yǎng)殖或野生魚體中分離出諸如虹彩病毒、彈狀病毒、呼腸病毒和水生雙RNA病毒等多科病毒的大量代表株。在對它們感染特性鑒定、病毒蛋白分析和基因組結(jié)構(gòu)解析的基礎(chǔ)上，病毒感染后引起的病毒與水產(chǎn)動物宿主細胞之間的關(guān)系問題越來越成為學者們研究的焦點，并有可能成為厘清病毒致病機制的主要切入點。

很多病毒感染細胞后細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，這種凋亡過程可能是細胞為應(yīng)對病毒侵染而采取的自保措施，從而避免更多的鄰近細胞死亡。但就病毒而言，一方面可能與宿主細胞Bcl-2等抗凋亡蛋白家族成員相互作用，阻止細胞更早死亡從而延長自身的持續(xù)性感染時間，擴增更多的子代病毒粒子；另一方面病毒也可能推動細胞更快的凋亡裂解從而利于自身的釋放和擴散。不同病毒株感染后誘導的細胞凋亡功能不一，需要依據(jù)具體的感染模型來分析。魚類病毒感染引起的細胞凋亡的功能研究目前已有一些進展，但需要更多深入研究實例來支撐細胞凋亡在病毒感染中扮演的角色。

相對于凋亡，魚類病毒誘導的細胞自噬是最近幾年新興的研究領(lǐng)域，相關(guān)方面的研究進展也較少，僅在幾株病毒上有初步的研究嘗試。尤其是自噬作為一種具有復雜調(diào)控機制的細胞程序性自主行為，在不同的細胞里差別很大，同一魚類病毒株在侵染不同宿主細胞后其胞內(nèi)自噬的發(fā)生及差異機制研究等尚未涉及，急需在未來有更多這方面的報道。此外，目前已有較多病原體同時誘導細胞凋亡和自噬的報告，對兩者之間的“串話”(Crosstalk)關(guān)系也進行了較深入地探討[35]。但水產(chǎn)動物病毒誘導的細胞自噬與凋亡之間的調(diào)控關(guān)系尚未見報道。更深入地探討魚類病毒誘導的細胞程序性死亡機制有助于這些問題的解決，并可以為闡明這些病毒的致病機理和開發(fā)相應(yīng)的防控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。