李 迅,黃小燕

（上海亙泰實(shí)業(yè)集團(tuán)，上海201015）

喹乙醇（Olaquindox），屬喹惡啉類，又名喹酰胺醇，商品名倍育諾、快育靈等，由于大量研究發(fā)現(xiàn)喹乙醇具有的潛在毒性，大量或長(zhǎng)期使用會(huì)引起較嚴(yán)重的中毒反應(yīng)，另一方面，喹乙醇還可以通過食物鏈的富集作用危害人類身體健康 （王仁華等，2017）。因此，歐盟從1999年開始全面禁止使用喹乙醇。針對(duì)上述情況，本文為在低于35kg豬的生長(zhǎng)過程中高效、合理利用低毒的抑菌藥物喹乙醇提供理論依據(jù)。

1　材料

1.1　主要器材

濾紙片，試管，試管架，平皿，離心管，燒杯，1ml移液槍，5ml移液槍，錐形瓶，電子天平，高壓滅菌鍋，水浴鍋，離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，超聲清洗器，恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2　供試菌種

大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌（salmonella）均由華南師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3　試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，LB瓊脂培養(yǎng)基，MH肉湯培養(yǎng)基，氯化鈉，蒸餾水，喹乙醇粉末等。

2　方法

2.1　抑菌試驗(yàn)

2.1.1　試劑的配制

喹乙醇（100ppm）：市場(chǎng)上銷售的喹乙醇粉劑中喹乙醇的含量是50%，配制純的100ppm喹乙醇，就要每100ml水中加入喹乙醇粉劑20mg。

2.1.2　平板的制作

將LB瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，待冷卻至 60℃左右，于超凈工作臺(tái)內(nèi)分別倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約 15ml，迅速蓋好皿蓋并輕輕晃動(dòng)，保證培養(yǎng)基均勻鋪于皿底，待冷卻凝固。將活化后的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分別密涂于LB瓊脂培養(yǎng)基上。

2.1.3　紙片法

取直徑 6mm的滅菌濾紙片放入制備好的喹乙醇藥物中，充分浸泡2h。用無菌鑷子夾取被喹乙醇泡過的濾紙片，分別貼于含菌平板上，每皿貼4片，中間空白對(duì)照貼無菌生理鹽水泡過的濾紙片，每種菌重復(fù)三皿，將貼好藥敏片的培養(yǎng)皿放于 36℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)18～20h。取出觀察結(jié)果，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，比較抑菌效果。重復(fù)試驗(yàn)3次，取各測(cè)量值的平均值。

2.2　最小抑菌濃度的測(cè)定

2.2.1　原理

醫(yī)學(xué)上用來測(cè)試細(xì)菌對(duì)藥物敏感性的一種方法，用此法來測(cè)定飼料添加劑的最小抑菌濃度，先將測(cè)試飼料添加劑作一系列倍比稀釋，然后各試管加入適當(dāng)稀釋的試驗(yàn)菌液，搖勻，經(jīng)培養(yǎng)后觀察，以飼料添加劑最小抑菌濃度(MIC)管，即為試驗(yàn)菌株的敏感度。

2.2.2　實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.2.1用LB瓊脂培養(yǎng)基倒平板，制作含有固體培養(yǎng)基的無菌平皿，將保存在-20℃冰箱的大腸桿菌菌株劃線接種到平皿中，37℃培養(yǎng)分離得到單菌落，再取單菌落劃線接種到平皿中，得到單菌落，此步驟重復(fù)兩次以上。

2.2.2.2在超凈工作臺(tái)中操作，將從步驟1中得到的單菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，得到菌懸液，37℃培養(yǎng)18h后，取菌懸液，用生理鹽水稀釋菌懸液，比對(duì)麥?zhǔn)媳葷峁?，使菌懸液中菌濃度近似值?.5麥?zhǔn)蠞舛?，然后根?jù)這個(gè)倍數(shù)，用MH肉湯培養(yǎng)基稀釋菌懸液得到0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木骸?/p>

2.2.2.3制備1000ppm濃度的喹乙醇溶液：稱取200mg含有50%喹乙醇濃度的粉末，溶解于已經(jīng)滅菌了的100mlMH肉湯培養(yǎng)基中，在50℃～60℃的水浴鍋中加熱，促進(jìn)溶解，然后用離心機(jī)離心得到澄清的含有1000ppm喹乙醇的MH肉湯培養(yǎng)基。

2.2.2.4在超凈工作臺(tái)中操作，取16支滅菌試管，編號(hào)1～16，1號(hào)試管加5ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉湯培養(yǎng)基，2、3、4、……、13、14、16 號(hào)試管加 5ml滅菌了的 MH 肉湯培養(yǎng)基，第15號(hào)試管加5ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉湯培養(yǎng)基作為對(duì)照。

2.2.2.5接著在步驟4后進(jìn)行二倍稀釋，第2號(hào)試管加入5ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉湯培養(yǎng)基，輕微搖晃混勻，得到第2號(hào)試管內(nèi)喹乙醇濃度為500ppm，接著從第2號(hào)試管取出5ml液體到第3號(hào)試管內(nèi)，輕微搖晃混勻，得到第3號(hào)試管內(nèi)喹乙醇濃度為250ppm，……，依次逐管進(jìn)行稀釋到第14管，從14管取出5ml液體倒掉，從而得到第1～14號(hào)試管內(nèi)喹乙醇濃度分別為：1000、500、250、125、64、32、16、8、4、2、1 和 0.5ppm。

2.2.2.6接種：向第1-14、16號(hào)試管內(nèi)接種1ml的0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙海?6號(hào)試管也作為對(duì)照組，第15號(hào)試管加1ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉湯培養(yǎng)基，輕微搖晃混勻，用過濾膜封口試管，在37℃、150r/min的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

2.2.2.7觀察并記錄：24h后將試管取出，觀察結(jié)果，以無菌生長(zhǎng)的最低藥液濃度作為喹乙醇的最小抑菌濃度，重復(fù)試驗(yàn)3次。

3　結(jié)果

圖1　100ppm喹乙醇抑菌圈平板圖

圖2　1000ppm喹乙醇抑菌圈平板圖

表1　喹乙醇（1000ppm）抑菌圈直徑

3.1　抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)圖1和圖2觀察發(fā)現(xiàn)，低濃度的喹乙醇沒有表現(xiàn)出抑菌效果，而高濃度的喹乙醇有抑菌效果，且只對(duì)陰性菌有抑制作用，對(duì)陽(yáng)性菌沒有抑制作用；從表1和圖2得出：1000ppm喹乙醇對(duì)沙門氏菌的效果要大于大腸桿菌。

3.2　最小抑菌濃度的測(cè)定

下圖3中觀察得到高濃度喹乙醇情況下試管內(nèi)液體澄清，抑菌效果明顯，低濃度喹乙醇情況下出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，濃度越低，渾濁現(xiàn)象越明顯，從而抑菌作用也越來越小。對(duì)照組第15號(hào)試管澄清，另一對(duì)照組第16號(hào)試管出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。

圖3　16支試管渾濁現(xiàn)象圖

4　結(jié)論

本試驗(yàn)同時(shí)采用試管二倍稀釋法聯(lián)合紙片法對(duì)喹乙醇進(jìn)行了體外抑菌作用研究，克服了以往試驗(yàn)的不足，既定性又定量地體現(xiàn)了喹乙醇的抑菌作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示喹乙醇對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有抑菌效果，印證了喹乙醇對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌等陰性菌有較強(qiáng)的抑菌效果，但沒有得出對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌效果，這可能是需要更高的喹乙醇濃度才對(duì)金黃色葡萄球菌等陽(yáng)性菌有抑菌效果。喹乙醇是一種可以使用的添加劑，但必須嚴(yán)格按照農(nóng)業(yè)部的規(guī)定，限制用量及其飼喂對(duì)象，因此，規(guī)范喹乙醇的使用，在飼料當(dāng)中精確的添加喹乙醇，既能促進(jìn)豬的健康生長(zhǎng)，又能抑殺致病菌，對(duì)于養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重要的作用。

[1]宋春美,侯玉澤,劉宣兵,等.喹乙醇的危害及檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,38(12)：13-17.

[2]王仁華,練小華,謝益根.飼料中喹乙醇的應(yīng)用效果研究[J].飼料與畜牧：新飼料,2017(2)：56-57.

[3]鄔溪芮,張珍珍.喹乙醇的危害及其檢測(cè)方法[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊,2017(9).