王昕凝，孫雪峰，祖 強，盧錦山，黃 銀，董 雋解放軍總醫(yī)院 泌尿外科，北京 0085；解放軍總醫(yī)院 腎病科，北京 0085；國家蛋白質(zhì)科學中心(北京)數(shù)據(jù)科學課題組，北京 006

尿液是血液經(jīng)過腎小球濾過及腎小管和集合管重吸收、分泌后產(chǎn)生的一種體液，其組成成分與腎生理及病理變化密切相關，也與機體整體代謝狀態(tài)相關[1]。因此，腎移植受者尿液蛋白組分變化可以反映移植腎生理狀態(tài)[2]。本研究的目的是運用定量蛋白質(zhì)組學的方法檢測移植腎正常受者及其相應供者的尿液蛋白質(zhì)組差異，探討功能正常的移植腎與健康腎是否存在差異。

對象和方法

1 研究對象 研究納入了5對于2010 - 2014年在解放軍總醫(yī)院行腎移植術后3年以上的腎移植受者及其相應供者，供受者關系均為父母-子女關系。納入標準：1)活體供腎，供受者均無明顯全身或泌尿系統(tǒng)疾??；2)受者接受腎移植術后3年以上；3)受者未發(fā)生明確的慢性或急性排異反應。所有腎移植受者均采取三聯(lián)免疫抑制治療方案：潑尼松+麥考酚嗎乙酯+他克莫司。所有供受者均于解放軍總醫(yī)院行尿常規(guī)、血常規(guī)、肝腎功能、B超等相關檢查以排除全身或泌尿系統(tǒng)疾病。

2 標本收集及處理 收集10例受試者晨尿。取1 ml尿液加入2 ml超速離心管中，室溫下2 000×g離心75 min，棄去上清；向離心管中加入50μl懸浮緩沖液(50 mmol/L Tris，250 mmol/L蔗糖，pH 8.5)，室溫放置15 min，之后加入2.5μl 1 mmol/L二硫蘇糖醇，混勻65℃加熱30 min；向離心管中加入200μl清洗緩沖液(10 mmol/L TEA，100 mmol/L NaCl，pH 7.4)，2 000×g離心30 min，棄去上清，向棄去上清的離心管內(nèi)加入30μl消化緩沖液(50 mmol/L NH4HCO3，pH 8.5)， 之 后加 入 500 ng測序級胰酶(Sequencing Grade Modified Trypsin，Promega)，混勻后在37℃孵育4 h消化蛋白；所得肽樣品用于后續(xù)的質(zhì)譜分析。

3 液相質(zhì)譜分析 消化后所得肽樣品用20 μl的上樣緩沖液(5%甲醇，0.1%甲酸)溶解，然后取5μl上樣，利用ThermoScientific的納升級液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)(nLC-Easy1000-Q Exactive-HF)進行數(shù)據(jù)采集。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Mascot2.3搜索引擎Proteome Discoverer V2.0進行肽序列數(shù)據(jù)庫搜索分析。所用數(shù)據(jù)庫為美國生物技術信息國家中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的人類蛋白質(zhì)參考序列數(shù)據(jù)庫。并利用DAVID對分析得到的差異蛋白列表進行GO富集分析，P＜0.05即表示差異蛋白在該GO條目中出現(xiàn)了富集。采用IPA通路數(shù)據(jù)庫對差異蛋白列表進行生物通路分析，P＜0.05即表示差異蛋白在該通路條目中出現(xiàn)了富集。

結(jié) 果

1 供受者一般情況 所有供受者均接受供腎切取術及腎移植術3年以上，且均為父母供腎-子女受腎關系，至隨訪時無明顯全身或泌尿系統(tǒng)疾病。供受者一般情況見表1。

2 尿蛋白質(zhì)組差異蛋白 我們在所有尿樣本中共檢測出465個肽段≥1的特異蛋白，有12個蛋白在每對供受者中均存在差異。在腎移植受者尿液中高表達的蛋白有8個，分別為二磷酸腺苷核糖基轉(zhuǎn)移酶3、碳酸酐酶4、視黃醇結(jié)合蛋白4、基底細胞黏附分子、過氧化物酶6、乳酸脫氫酶B、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3和絲氨酸蛋白酶抑制劑A1。腎移植受者尿液中低表達的蛋白有4個：細胞液泡蛋白質(zhì)分選因子4B、囊泡運輸體1、Bro1包涵域蛋白及三肽氨基肽酶1。見表2。

3 差異蛋白GO功能注釋 我們對差異蛋白進行了GO注釋分析。細胞組分注釋主要為細胞外分泌體、細胞外環(huán)境等。生理過程注釋主要包括急性期反應、ESCRTⅢ復合體解聚、病毒生命周期等。分子功能注釋主要為蛋白結(jié)合作用。見表3。

4 差異蛋白參與通路分析 我們使用IPA通路數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行生物通路分析，差異蛋白主要參與的生物學通路包括急性期反應信號傳導、動脈粥樣硬化信號傳導、三酰甘油降解等涉及免疫反應、脂質(zhì)代謝的生物學通路。見表4。

表1 供受者一般情況Tab. 1 Characteristics of donors and recipients

表2 受者與供者尿蛋白質(zhì)組間的差異蛋白Tab. 2 Distinct proteins between urine proteome of donors and recipients

表3 差異蛋白GO功能學注釋Tab. 3 GO terms of distinct proteins

表4 差異蛋白生物通路分析Tab. 4 Pathways of distinct proteins

討 論

尿蛋白質(zhì)組學技術的成熟可使我們對移植腎免疫反應的病理生理學機制進行探索[3-4]，同時也為尋找無創(chuàng)排異反應特異性標記物提供了良好的研究方法[5]。本研究中，我們對5對移植腎功能正常的受者及其相應供者進行尿蛋白質(zhì)組檢測及生物學功能分析。

我們在供受者尿液中共發(fā)現(xiàn)了12個含量差異較大的蛋白，并對這些差異蛋白進行了GO注釋分析和生物學通路分析。GO注釋分析提示差異蛋白主要存在于細胞外液或血小板顆粒內(nèi)。尿液所含蛋白中，定位于細胞外的蛋白主要來源于泌尿系統(tǒng)對血漿的過濾、分泌作用，表達含量相對較穩(wěn)定；而定位于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)則主要由于腎、尿道、膀胱組織表皮脫落細胞衰老或者損傷導致細胞破損而釋放入尿液，這些蛋白相對而言表達不穩(wěn)定[6]。另外差異蛋白主要為結(jié)合蛋白，提示差異蛋白可能參與信號通路的傳導。生理過程分析提示，相關差異蛋白的生物學功能主要為物質(zhì)轉(zhuǎn)運、復合體組件及參與免疫反應。而差異蛋白參與通路主要為免疫反應、脂質(zhì)代謝等生物學通路。供受者尿液中蛋白質(zhì)含量差異可能與移植腎在受者體內(nèi)的生理變化有關。

國內(nèi)外有報道差異蛋白SERPINA3及其家族內(nèi)的其他蛋白(SERPINA1等)在急性排異反應患者的體內(nèi)表達異常[7-13]。SERPINA家族蛋白是一種胰蛋白酶抑制劑，可以作用于包括絲氨酸蛋白酶在內(nèi)的多種靶點，而SERPINA3在體內(nèi)的表達異常與機體免疫系統(tǒng)對移植物的排異反應有關，抑制組織蛋白G的活性[14-15]，而組織蛋白酶G則是一種與排異反應相關的粒細胞蛋白酶[16]。相比功能正常的腎移植受者，發(fā)生急性排異反應受者尿液中SERPINA3明顯增高。賈雄飛等[17]對發(fā)生急性排異反應的腎移植受者行尿蛋白質(zhì)組檢測時發(fā)現(xiàn)，SERPINA3前體在急性排異反應受者尿液中明顯升高，且隨免疫抑制劑的應用而逐漸降低，機制為控制CD8+T細胞的過度活化而增加了SERPINA3的合成及釋放。O'Riordan等[7]對急性排異受者及穩(wěn)定受者進行了腎組織活檢后發(fā)現(xiàn)，二者腎組織中總SERPINA3含量并無明顯差異，考慮SERPINA3在尿液中的升高可能是其與靶向蛋白酶相互作用的結(jié)果，提示其靶向蛋白酶在急性排異反應受者體內(nèi)活性升高；而Ziegler等[18]對腎移植術后急性排異反應發(fā)生及治療后的血漿組分研究中發(fā)現(xiàn)，SERPINA3的C端片段對檢測排異反應有著100%的敏感性及94%的特異性。本研究中我們所納入的移植腎正常的受者均無臨床排異反應發(fā)生，但SERPINA3及SERPINA1在受者尿液中含量較供者升高，提示相關靶向蛋白活性在移植腎正常的受者體內(nèi)與健康腎有差異。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)腎移植術后受者與供者尿蛋白質(zhì)組存在差異，此差異主要與能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運及免疫反應等生理功能有關。

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