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(海南大學(xué)食品學(xué)院,生物活性物質(zhì)與功能食品開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南海口 570228)

羅非魚屬鱸形目麗魚科,原產(chǎn)于非洲,別稱非洲鯽魚,非鯽、越南魚等。體肥味鮮,極易養(yǎng)殖[1]。近年來(lái),隨著人們對(duì)保健產(chǎn)品的認(rèn)可度不斷增強(qiáng),魚油提取與開(kāi)發(fā)已成為世界研究熱點(diǎn)。魚油富含ω-3多不飽和脂肪酸,其中二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)能顯著地促進(jìn)嬰兒智力發(fā)育、提高記憶力、改善視力,二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid,EPA)可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓,抑制過(guò)敏反應(yīng)等,在人體中具有重要的生物學(xué)意義[2-4]。目前魚油提取方法主要包括:蒸煮法、稀堿水解法、酶解法和超臨界萃取法等[5]。蒸煮法等傳統(tǒng)提取方法,相對(duì)提取率較低,浪費(fèi)較嚴(yán)重,而超臨界萃取法等對(duì)于設(shè)備要求較高,不易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)化[5-8]。微波輔助萃取是近年來(lái)興起的一種油脂提取分離技術(shù),多應(yīng)用于植物油脂的提取,至今未見(jiàn)有關(guān)于微波輔助提取魚油的報(bào)道[9-11]。在微波場(chǎng)中,微波能加熱,而不同的物質(zhì)對(duì)微波能吸收度不同,這就使得萃取體系中的某些組分被選擇性加熱從而萃取出來(lái)[12]。微波輔助萃取相比其他傳統(tǒng)提取方法,具有升溫快速均勻,熱效率高,無(wú)污染,溶劑回收率高等優(yōu)點(diǎn),大大縮短了提取時(shí)間,提高萃取率,節(jié)約成本[13]。

自2012年以來(lái),國(guó)內(nèi)羅非魚進(jìn)出口市場(chǎng),主要以銷售鮮魚和冷凍魚片為主,產(chǎn)生了大量的下腳料(魚頭、魚皮、魚骨、內(nèi)臟等)[14]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于羅非魚的魚油提取及脂肪酸分析,主要以魚頭和內(nèi)臟為主。鄒舟等[15]通過(guò)研究鰱魚各部位脂質(zhì)分布及脂肪酸組成,發(fā)現(xiàn)魚各個(gè)部位的脂肪酸組成及含量具有較大差異,尤其是DHA、EPA、花生四烯酸等。分析羅非魚各個(gè)部位的脂肪酸,可以更加科學(xué)的利用加工過(guò)程中產(chǎn)生的下腳料。

在傳統(tǒng)研究中,通常是將鮮魚進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗晾干,然后提取其魚油。然而,該方法難以保證原材料含水量的均一性。因此,本實(shí)驗(yàn)采用冷凍干燥法預(yù)先處理原材料,然后通過(guò)微波輔助萃取魚油,在單因素基礎(chǔ)上,應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)法確定最佳工藝,并通過(guò)氣相色譜儀對(duì)整魚及各個(gè)部位的魚油脂肪酸組成和含量進(jìn)行分析,為近一步科學(xué)的綜合利用羅非魚提供新途徑。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

新鮮羅非魚5～7月份,重約1.5 kg,長(zhǎng)約25 cm,寬約14 cm,?？谑惺?正己烷、石油醚(沸程60～90 ℃)、乙酸乙酯、丙酮、草酸、乙酸甲酯均為分析純,廣州化學(xué)試劑公司;正己烷色譜純,美國(guó)Fisher公司;脂肪酸GLC-463NU-CHEK-PREP公司。

7890A氣相色譜儀、全自動(dòng)進(jìn)樣器、FID檢測(cè)器、cp-sil88毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)Agilent有限公司;CW-2000超聲波-微波協(xié)同萃取儀上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司;EV321旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀北京萊伯泰科技有限公司;JM-B20002電子天平諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原材料預(yù)處理整魚:羅非魚洗凈,晾干,去掉苦膽,切塊,在-18 ℃冰箱下冷凍24 h,放入真空冷凍干燥機(jī),-80 ℃下,凍干48 h,粉碎,樣品放入樣品袋,密封,存放于-80 ℃冰箱中待用;各個(gè)部位:羅非魚洗凈,去掉苦膽,然后分解為魚頭、魚尾、魚皮、內(nèi)臟、魚肉和魚骨,晾干,在-18 ℃冰箱下冷凍24 h,放入真空冷凍干燥機(jī),-80 ℃下,凍干48 h,粉碎,樣品放入樣品袋,密封,存放于-80 ℃冰箱中待用。

1.2.2整魚魚油的提取稱取一定量的樣品,加入適當(dāng)?shù)娜軇?放入超聲波-微波協(xié)同萃取儀,按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置參數(shù),進(jìn)行提取。提取結(jié)束后,取出提取瓶,抽濾,濾紙用正己烷沖洗,濾液移至旋蒸瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重,旋蒸瓶?jī)?nèi)油脂,即為羅非魚粗魚油,稱量其質(zhì)量,計(jì)算魚油萃取率(DW)[6]。

1.2.3羅非魚魚油萃取率計(jì)算公式

式中:m0為旋蒸瓶質(zhì)量量(g);m1為(旋蒸瓶+魚油)質(zhì)量(g);m2為羅非魚樣品質(zhì)量(g)。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1萃取溶劑的選擇料液比1∶8 (g/mL),微波功率100 W,萃取時(shí)間10 min,考察不同萃取溶劑(正己烷、石油醚(沸程60～90 ℃)、乙酸乙酯、丙酮)對(duì)萃取率的影響,選擇毒性較小,萃取率相對(duì)較好的溶劑為實(shí)驗(yàn)萃取溶劑。

1.2.4.2料液比萃取溶劑為正己烷,微波功率100 W,萃取時(shí)間10 min,考察料液比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12) (g/mL)對(duì)魚油萃取率的影響。

1.2.4.3微波功率萃取溶劑為正己烷,料液比1∶8 (g/mL),萃取時(shí)間10 min,考察微波功率(60、80、100、120、150 W)對(duì)魚油萃取率的影響。

1.2.4.4萃取時(shí)間萃取溶劑為正己烷,料液比1∶8 (g/mL),微波功率100 W,考察萃取時(shí)間(3、5、10、12、15 min)對(duì)魚油萃取率的影響。

1.2.5正交實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),選擇正己烷為萃取溶劑,選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。

表1　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1　Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.6氣相色譜分析羅非魚魚油脂肪酸組成脂肪酸甲酯化:取適量魚油樣品,加入1.5 mL色譜級(jí)正己烷溶劑,依次加入40 μL乙酸甲酯和100 μL甲醇鈉-甲醇溶液(0.5 mol/L),混勻。在室溫條件(25 ℃左右)反應(yīng)20 min后,立即在-18 ℃下冷凍10 min,迅速加入60 μL草酸,于4000 r/min下離心5 min后,吸取上層清液,加入2.0 g無(wú)水硫酸鈉除去水分,濾液經(jīng)0.22 μm濾膜注入進(jìn)樣瓶,氮?dú)獯蹈?加入1 mL色譜級(jí)正己烷,待測(cè)[17]。

氣相色譜條件:cp-sil88毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm),載氣:H2,燃燒氣:N2,H2和空氣。進(jìn)樣口溫度250 ℃。程序升溫條件:起始溫度為45 ℃,保持4 min。以13 ℃/min升溫至175 ℃,保持27 min。再以4 ℃/min升溫至215 ℃,保持35 min。脂肪酸的分析參照GLC-463脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)圖譜,脂肪酸的百分含量釆用面積歸一化法確定(以峰值面積的百分比表示)。

1.2.7羅非魚魚油理化指標(biāo)的測(cè)定酸值:GB 5009.229-2016;過(guò)氧化值:GB 5009.227-2016;碘值:GB/T 5532-2008;不皂化物:GB/T 5535.2-2008;水分及揮發(fā)物:GB 5009.236-2016。

1.3　數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1　羅非魚魚油提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1萃取溶劑對(duì)魚油萃取率的影響在微波場(chǎng)中,極性溶劑的介電常數(shù)越大,吸收的微波能量就越多,細(xì)胞內(nèi)的溫度就會(huì)在瞬間升高,導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂,油脂容易被釋放出來(lái)[18]。如圖1所示,乙酸乙酯作為萃取溶劑時(shí),魚油的萃取率最高(27.83%±0.56%);丙酮與正己烷的萃取率接近,分別為(24.66%±0.97%)和(23.35%±0.77%),石油醚的萃取率最低(20.11%±0.67%)。由于乙酸乙酯和丙酮的毒性較大,且工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中常選用正己烷作為萃取溶劑[19]。因此,從安全性、經(jīng)濟(jì)效益及實(shí)際生產(chǎn)等多個(gè)因素綜合考慮,接下來(lái)的單因素和正交實(shí)驗(yàn)選擇正己烷作為羅非魚魚油萃取溶劑。

圖1　萃取溶劑對(duì)魚油萃取率的影響Fig.1　Effect of extraction solvent on fish oil extraction rate

2.1.2料液比對(duì)魚油萃取率的影響如圖2所示,當(dāng)料液比從1∶4 (g/mL)增加到1∶12 (g/mL),羅非魚魚油萃取率先增大后下降;當(dāng)料液比1∶6 (g/mL)時(shí),魚油萃取率最高(27.14%±0.14%)?？赡苁且?yàn)楫?dāng)魚粉質(zhì)量一定時(shí),料液比越大,反應(yīng)接觸面積越大,油脂較容易浸出。但當(dāng)萃取溶劑用量達(dá)到一定量后,微波在穿透溶劑過(guò)程中會(huì)衰減,萃取溶劑越多,使得到達(dá)基提物質(zhì)的微波能越少,同時(shí),萃取溶劑量增大,也會(huì)延長(zhǎng)溶劑的回收時(shí)間[20]。而由圖2可知，雖然料液比1∶6～1∶10 g/mL的過(guò)程中，萃取率在下降，但仍然比1∶4 g/mL時(shí)要大，因此進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)時(shí)，先取1∶6～1∶10 g/mL 3個(gè)水平。

圖2　料液比對(duì)魚油萃取率的影響Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on fish oil extraction rate

2.1.3微波功率對(duì)魚油萃取率的影響如圖3所示,隨著微波功率(60～150 W)的增加,羅非魚魚油萃取率先增加后降低;當(dāng)微波功率100 W時(shí),魚油萃取率最高(28.27%±0.29%)。微波功率的增大,對(duì)羅非魚蛋白質(zhì)與魚油結(jié)合的部分破壞更加充分,使得魚油萃取率增大。然而當(dāng)微波功率大于100 W時(shí),微波累積的熱量會(huì)導(dǎo)致溫度升高,溶劑沸騰,造成低沸點(diǎn)揮發(fā)油損失,以致萃取率降低[16]。

圖3　微波功率對(duì)魚油萃取率的影響Fig.3　Effect of microwave output power on fish oil extraction rate

2.1.4萃取時(shí)間對(duì)魚油萃取率的影響如圖4所示,隨著萃取時(shí)間的增加,萃取率先升高后降低;在萃取10 min時(shí),魚油萃取率達(dá)到最大值26.30%。超過(guò)10 min,萃取率逐漸減少,原因可能是隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng),微波產(chǎn)熱增加,使得萃取溶劑揮發(fā)或低沸點(diǎn)揮發(fā)油損失,導(dǎo)致萃取率降低[21]。

圖4　萃取時(shí)間對(duì)魚油萃取率的影響Fig.4　Effect of time on fish oil extraction rate

2.2　正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取影響魚油萃取率各因素中適當(dāng)?shù)乃竭M(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析與方差分析,以確定最佳的反應(yīng)條件。采用L9(34)正交表,以料液比(A)、萃取時(shí)間(B)、微波功率(C)作為3個(gè)考察因素,選取3個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)極差分析可知,影響魚油的主次因素為:B>A>C。各因素的R值大于空列的R值,故各因素的水平效應(yīng)的差異是存在的。正交實(shí)驗(yàn)中魚油的最佳提取方案為A3B3C2，即正己烷為最佳萃取溶劑,當(dāng)料液比1∶10 (g/mL),萃取時(shí)間10 min,微波功率100 W，萃取率為(29.17%±0.13%)。由方差分析可知,料液比、提取時(shí)間對(duì)魚油萃取率影響極顯著,微波功率影響顯著。

表3　正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3　Variance analysis of orthogonal experiment

表2　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Design and results of orthogonal experiment

2.3　羅非魚脂肪酸組成

由表4可知,棕櫚酸(C16∶0,20.98%～23.20%)、油酸(9cC18∶1,19.06%～25.96%)和亞油酸(9c12cC18∶2,10.38%～15.74%)是羅非魚整魚及其6個(gè)部位中的主要脂肪酸。這與郝記明等[21]利用酶解法提取下腳料油脂測(cè)得脂肪酸結(jié)果一致。部分研究表明,棕櫚酸可抑制HSC的增值和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá),從而抑制肝纖維化[23]。而油酸是單不飽和脂肪酸,具有調(diào)節(jié)血糖血脂、降低膽固醇等功效[24]。亞油酸是人體必需脂肪酸,可促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育,部分研究表明,亞油酸對(duì)嬰幼兒的視力和智力發(fā)展有一定的影響。羅非魚魚油含量大于1%的脂肪酸還有C14∶0、9cC16∶1、C18∶0、11cC18∶1、C18∶3 n-3、11cC20∶1、C20∶4、C22∶4及C22∶6n-3(DHA),大部分為不飽和脂肪酸,近年來(lái)許多研究表明不飽和脂肪與人體的健康息息相關(guān),不飽和脂肪酸可有效地促進(jìn)血液循環(huán)、抑制腫瘤和動(dòng)脈粥樣硬化、提高免疫力,增進(jìn)智力等[25-27]。因此羅非魚魚油具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

羅非魚整魚及其各部位中,飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)含量為(34.06%～39.89%),其中,C16∶0的含量最高(20.98%～23.20%),其次是C18∶0(5.48%～6.12%)和C14∶0(2.82%～3.51%);單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)的含量為(30.12%～37.55%),主要包括油酸(19.06%～25.96%)、棕櫚油酸(9cC16∶1,5.44%～6.14%)和11cC18∶1(3.31%～3.95%);ω-6 多不飽和脂肪酸的含量為(18.20%～21.94%),主要包括亞油酸(10.38%～15.74%)、花生四烯酸(C20∶4 n-6,1.06%～1.90%)和C22∶4 n-6(0.94%～2.43%)。相比較而言,ω-3 多不飽和脂肪酸的含量較少,為(4.93%～10.15%)。此外,在羅非魚中,還檢測(cè)到少量反式脂肪酸,含量為(1.69%～3.12%)。

由圖5可知,微波提取的羅非魚各個(gè)部位EPA+DHA含量差異較大,魚肉含量最高為(3.29%±0.07%),其次是魚尾和魚骨,內(nèi)臟含量最低為(1.59%±0.03%)。在以往的國(guó)內(nèi)外研究中,羅非魚脂肪酸組成及含量的研究主要集中在羅非魚頭和內(nèi)臟。而不飽和脂肪酸尤其是DHA+EPA的含量,往往成為衡量魚油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一項(xiàng)重要指標(biāo)。應(yīng)用微波提取的魚頭油中,DHA+EPA的含量為2.46%,而李夢(mèng)凡等[28]通過(guò)酶解法提取羅非魚頭油,得到DHA+EPA的含量?jī)H為1.36%;應(yīng)用微波提取的羅非魚魚肉油脂中,魚肉含量最高為(3.29%±0.07%),而張立堅(jiān)等[29]應(yīng)用氯仿-甲醇法提取的羅非魚魚肉油脂中DHA+EPA的含量?jī)H為2.71%,說(shuō)明微波輔助法提取的魚頭油品質(zhì)較好。魚內(nèi)臟中,微波輔助萃取得到的魚油DHA+EPA的含量為1.59%,孫麗霞等[30]分別研究索氏抽提、超聲提取、高壓脈沖電場(chǎng)提取三種方法得到的羅非魚內(nèi)臟油脂,其DHA+EPA的含量為1.91%～2.26%,與本測(cè)定結(jié)果略有差異,可能是由于羅非魚體內(nèi)脂肪隨季節(jié)和產(chǎn)地等的變化而略有變化[16]。

圖5　羅非魚各個(gè)部位(EPA+DHA)含量Fig.5　Contents of DHA+EPA from different parts of tilapia

表4　羅非魚整魚及各個(gè)部分脂肪酸組成和含量(%)Table 4　The fatty acids compositions of the whole fish and different parts(%)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3);-:未檢測(cè)到;SFA:飽和脂肪酸;MUFA:單不飽和脂肪酸;TFA:反式脂肪酸(trans fatty acids,TFA);PUFA:多不飽和脂肪酸。2.4羅非魚整魚及各個(gè)部位魚油理化性質(zhì)

表5　羅非魚整魚及各個(gè)部位理化指標(biāo)Table 5　Physical and chemical indexes of the whole fish and different parts of tilapia

在生物活性物質(zhì)的利用過(guò)程中,只有滿足了量的需求,才能追求質(zhì)的要求。而在羅非魚加工過(guò)程中,魚肉(腹肌)往往用于鮮食,而剩余部位大多為加工副產(chǎn)物。通過(guò)分析各個(gè)加工副產(chǎn)物部位油脂含量和他們的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,我們可以更好地對(duì)其進(jìn)行有效地利用。由表5可知,在羅非魚的各個(gè)部位中,采用微波輔助萃取法最優(yōu)工藝條件提取各個(gè)部位油脂,其中內(nèi)臟含油量最高為(31.59%±0.73%),其次為魚頭和魚皮,魚肉(腹肌)含油量最低(4.99%±0.26%)。從各個(gè)部位的理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3502-2000。但整體而言,內(nèi)臟油脂的各項(xiàng)理化指標(biāo)(如酸價(jià)、過(guò)氧化值、碘值等)明顯高于其他部位,可能是由于魚內(nèi)臟油脂的不飽和脂肪酸含量最高導(dǎo)致的,魚尾魚骨次之。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究微波輔助萃取羅非魚魚油條件對(duì)提取率和質(zhì)量的影響,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化魚油的提取工藝參數(shù),結(jié)果表明最佳萃取溶劑為正己烷,在料液比為1∶10 (g/mL),微波時(shí)間為10 min,微波功率為100 W時(shí),魚油提取率最高為29.17%±0.13%。整魚及各個(gè)部位提取的油脂,其理化指標(biāo)均符合粗魚油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。分析微波提取的羅非魚整魚及各個(gè)部位的脂肪酸組成和含量,可知羅非魚整魚及各個(gè)部位的脂肪酸主要由棕櫚酸(20.98%～23.2%)、油酸(19.06%～25.96%)及亞油酸(10.38%～15.74%)組成。SFA含量最多的為棕櫚酸,魚尾含量最高為23.20%±0.03%,魚頭次之。油酸是微波提取的羅非魚整魚及各個(gè)部位的主要單不飽和脂肪酸,內(nèi)臟含量最高為23.96%±0.10%。ω-3 PUFA是魚油最重要的脂肪酸,其中魚骨含量最高(10.15%±1.04%),魚皮次之。整魚DHA+EPA的含量為總脂肪酸的2.16%,魚尾最高為3.10%。羅非魚各個(gè)部位的脂肪酸差異顯著,可根據(jù)其脂肪酸特點(diǎn),選擇性地對(duì)其進(jìn)行加工利用,提高副產(chǎn)物利用價(jià)值。微波輔助萃取在縮短萃取時(shí)間的同時(shí)還大大提高了萃取率,且得到魚油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,因此微波輔助萃取法是羅非魚魚油提取的一種行之有效的方法,在工業(yè)生產(chǎn)中有較高的借鑒價(jià)值。

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