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恙蟲病(tsutsugamushi disease)又名叢林斑疹傷寒(scrub typhus)，是由恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamsushi)引起的以鼠類為主要傳染源和恙螨幼蟲叮咬傳播的一種自然疫源性疾病[1-2]。臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、焦痂或潰瘍、淋巴結(jié)腫大為主要特征，嚴(yán)重者可多器官損傷，甚至死亡[2-3]。恙蟲病在全球廣泛流行，主要分布于亞洲太平洋沿岸的熱帶及亞熱帶地區(qū)，包括中國(guó)、韓國(guó)、印度、斯里蘭卡、泰國(guó)、印度尼西亞、菲律賓、澳大利亞等國(guó)家[4]。我國(guó)恙蟲病多發(fā)生于東南、西南地區(qū)及沿海島嶼[5]。近年來(lái)，我國(guó)恙蟲病病例逐漸增多、疫區(qū)范圍不斷擴(kuò)大、流行強(qiáng)度不斷增加[6]。云南省位于我國(guó)西南邊陲高原山區(qū)，與緬甸、老撾、越南接壤，地理環(huán)境復(fù)雜多樣，以熱帶和亞熱帶氣候?yàn)橹?，是恙蟲病流行的主要省份[6]。云南恙蟲病主要分布滇西和滇南部，而滇東北地區(qū)少見報(bào)告[7]。滇東北地處云南北部金沙江流域，地形和氣候復(fù)雜，恙蟲病媒介恙螨群落復(fù)雜多樣[8]，但該地區(qū)恙蟲病發(fā)生和流行的研究較少[9]。為了解滇東北恙蟲病發(fā)生及流行狀況，2015年1-12月筆者在滇東北永善縣進(jìn)行了恙蟲病流行病學(xué)調(diào)查。

1　材料與方法

1.1樣本來(lái)源2015年10月在云南省永善縣耕地采用鼠夾誘捕法捕鼠，現(xiàn)場(chǎng)無(wú)菌解剖取鼠脾臟，置液氮保存。收集到永善縣2015年1-12月疑似恙蟲病發(fā)熱患者(發(fā)熱≥3 d，1-3周內(nèi)有野外活動(dòng)或田間勞作史，身體有焦痂/潰瘍、皮疹和/或淋巴結(jié)腫大)血清，置-80 ℃冰箱保存。

1.2病例資料依據(jù)《恙蟲病預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)》[10]中恙蟲病流行病學(xué)個(gè)案調(diào)查表對(duì)疑似恙蟲病病例進(jìn)行個(gè)案調(diào)查。

1.3主要試劑與儀器DNA提取試劑盒(Qiagen公司)、2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、膠體金法恙蟲病東方體抗體檢測(cè)試劑盒(廈門市波生生物技術(shù)有限公司，Lot: H15102903)、DNA Marker DL2000(大連寶生物公司)、MM400 組織研磨儀 (德國(guó)Retch公司)、T Professional PCR儀(德國(guó)Biometra公司)。

1.4膠體金免疫試驗(yàn)參照膠體金法恙蟲病東方體抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，對(duì)病人血清做恙蟲病東方體IgG和IgM抗體檢測(cè)。

1.5巢式PCR檢測(cè)用MM400 組織研磨儀研磨鼠脾樣品，并應(yīng)用Qiagen DNA試劑盒提取總DNA，采用文獻(xiàn)[11-12]中的引物及條件對(duì)DNA樣本做groEL基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積為25 μL,應(yīng)用2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，并設(shè)陰性對(duì)照。第1次擴(kuò)增時(shí)取2 μL DNA樣本為模板，第2次擴(kuò)增時(shí)取第1次擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL為模板。取第2次PCR產(chǎn)物(5 μL/孔)在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，擴(kuò)得的恙蟲病東方體目的基因片斷大小為364 bp。

1.6DNA序列測(cè)定及分析PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)定DNA序列。將所得序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)用Blast等對(duì)序列進(jìn)行同源性比較，并用MEGA6.06軟件Neighbor-joining法(Bootstrap值設(shè)定為1000)將相關(guān)恙蟲病東方體菌株groEL基因片段序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2　結(jié)　果

2.1膠體金法檢測(cè)共收集發(fā)熱病人血清34份，對(duì)這些血清做恙蟲病東方體抗體檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性24份(70.59%)，其中IgG陽(yáng)性10份(29.41%)，IgM陽(yáng)性21份(61.76%)。IgG或IgM單陽(yáng)性分別為3份和14份，IgG和IgM均陽(yáng)性7份。

2.2恙蟲病病例診斷參照恙蟲病預(yù)防控制技術(shù)指南[10]，依據(jù)患者流行病學(xué)史(流行季節(jié)，發(fā)病前3周到過(guò)恙蟲病流行區(qū)，并有野外活動(dòng)史)、臨床表現(xiàn)(發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、皮疹、焦痂或潰瘍等)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果(恙蟲病東方體抗體檢測(cè)陽(yáng)性、核酸檢測(cè)陽(yáng)性或分離到病原體)進(jìn)行綜合分析與診斷。在34例恙蟲病患者中，實(shí)驗(yàn)室確診病例21例(IgM陽(yáng)性)，臨床診斷病例13例(有恙蟲病相關(guān)流行病學(xué)史、發(fā)熱、焦痂/潰瘍或/和皮疹)。

2.3流行病學(xué)資料在2015年5-10月共發(fā)現(xiàn)恙蟲病34例，其中8月發(fā)病最多(32.35%)，其次7月(29.41%)和9月(14.71%)。發(fā)病年齡在2～72歲(中位數(shù)40.5歲)，40～49歲患者最多(32.35%)，其次30～39歲(17.65%)和2～9歲(14.71%)。其中，農(nóng)民30例(79.41%)、散居兒童5例(14.71%)、學(xué)生2例(5.88%)，男與女性別比為17/17(表1)。

表1永善縣恙蟲病患者的發(fā)病季節(jié)與年齡分布
Tab.1Seasonal and age distribution of scrub typhus patients in Yongshan County

年齡(歲)病例數(shù)(%)月份(月)病例數(shù)(%)<105(14．71)1—40(0．00)10～2(5．88)52(5．88)20～3(8．82)62(5．88)30～6(17．65)710(29．41)40～11(32．35)811(32．35)50～4(11．76)95(14．71)60～1(2．94)104(11．76)>702(5．88)11—120(0．00)

2.4發(fā)病情況34例恙蟲病患者均有發(fā)熱，持續(xù)或間斷發(fā)熱3～21 d，體溫在37.6 ℃～41 ℃，呈弛張熱型或稽留熱，一些患者伴有寒戰(zhàn)、頭痛、結(jié)膜充血、淋巴結(jié)腫大、皮疹、焦痂/潰瘍等。有焦痂或潰瘍的患者32例(94.12%)，其中焦痂或潰瘍位于腹股溝10例(31.25%)，其次會(huì)陰的8例(25%)，腋窩的4例(12.50%)，胸部、臍周和下腹的各2例，頸部、背部、臀部和肛周的各1例。臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高占35.29%，淋巴細(xì)胞比例升高的占41.18%，嗜酸性粒細(xì)胞比例下降的占44.12%，谷草轉(zhuǎn)氨酶升高的占44.12%(表2)。

表2永善縣恙蟲病患者主要臨床特征
Tab.2Main clinical characteristics of scrub typhus patients in Yongshan County

臨床表現(xiàn)病例數(shù)(%)臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病例數(shù)(%)發(fā)熱34(100)白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高12(35．29)焦痂或潰瘍32(94．12)中性粒細(xì)胞比例升高3(6．98)頭痛24(70．59)淋巴細(xì)胞比例升高14(41．18)寒戰(zhàn)23(67．65)嗜酸性粒細(xì)胞比例下降15(44．12)皮疹17(50)血小板計(jì)數(shù)減少7(20．59)淋巴結(jié)腫大8(23．53)谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高13(38．24)眼結(jié)膜充血7(20．59)谷草轉(zhuǎn)氨酶升高15(44．12)

2.5巢式PCR檢測(cè)及序列分析在農(nóng)耕地放置鼠夾400個(gè)，一共捕獲鼠類39只，均為黃胸鼠。對(duì)39份鼠脾做groEL基因檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增到364 bp大小的groEL片斷9份(陽(yáng)性率23.08%)。

2.6基因groEL序列分析應(yīng)用MegAlign軟件將測(cè)序獲得的樣本groEL基因片段序列(361 bp)與GenBank中已知參考菌株相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果序列YSP20、YSP22、YSP23、YSP26、YSP28、YSP33、YSP34、YSP35之間的同源性均為100%，YSP30與YSP20的同源性為99.4%。YSP20與Zhou/2012、UT213、SH205、Jin/2012的同源性均為100%，與Karp(M31887)和Kato(JX188393)的同源性均為99.7%，與 Kato(AY191586) 的同源性為99.4%，與 Gilliam的同源性為94.7%。YSP30與HSB1、FAR1、2049、UAP4、UAP1的同源性100%，與Karp的同源性為99.7%，與 Kato(JX188393)和Kato(AY191586) 的同源性分別為99.2%和98.9%，與 Gilliam的同源性為94.2%。

2.7系統(tǒng)進(jìn)化樹分析根據(jù)groEL基因片段序列(361 bp)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果YSP30序列與日本HSB1、FAR1、UAP4、UAP1株和泰國(guó)2049株在同一分支上，表明本次檢測(cè)到的YSP30株與泰國(guó)2049、日本HSB1等恙蟲病東方體菌株的遺傳進(jìn)化關(guān)系最密切；而YSP20等8株與泰國(guó)UT213和UT221、日本SH205、中國(guó)浙江Zhou/2012和Jin/2012株在同一個(gè)分支上，表明YSP20等8株與泰國(guó)UT213、日本SH205、中國(guó)浙江Zhou/2012和Jin/2012株的遺傳進(jìn)化關(guān)系最密切(圖1)。

圖1　根據(jù)恙蟲病東方體groEL基因片段序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1　The phylogenetic tree constructed with partial groEL sequences from O.tsutsugamushi strains

3　討　論

云南素有“動(dòng)植物王國(guó)” 之稱，宿主動(dòng)物及媒介十分豐富，是恙蟲病、斑疹傷寒、斑點(diǎn)熱等多種立克次體疾病的高發(fā)地區(qū)[13-15]。近年來(lái)，該省恙蟲病和斑疹傷寒局部暴發(fā)較為頻繁[16]。永善縣為云南東北部，地處烏蒙山脈西北面的金沙江南岸，海拔高低懸殊(340～3 199.5 m)，氣候垂直變化顯著，年均氣溫16.4 ℃，年均降水量666 mm，屬中亞熱帶濕潤(rùn)氣候區(qū)，適宜恙蟲病主要宿主動(dòng)物黃胸鼠和媒介恙螨的生存,黃胸鼠和恙螨較多[8]。永善縣1973年曾證實(shí)存在恙蟲病的流行[9]。2015年5-10月對(duì)永善縣恙蟲病疑似病例34例進(jìn)行確認(rèn)，其中實(shí)驗(yàn)室確診病例21例、臨床診斷病例13例。對(duì)該恙蟲病病例做流行病學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其多發(fā)生在夏季7月和8月，發(fā)病年齡以30～49歲青壯年農(nóng)民多見，與以往報(bào)告的云南省恙蟲病流行情況基本一致[17]。本次研究的恙蟲病患者中，焦痂或潰瘍的發(fā)生率為94.12%，高于泰國(guó)[18]、山東[19]、安徽[20]等的73.1%～88.5%；皮疹的發(fā)生率為50%，高于泰國(guó)的32.1%[18]，與安徽的52.9%[20]相近。本次患者的焦痂或潰瘍多位于腹股溝、其次位于會(huì)陰。臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，本次患者的谷草轉(zhuǎn)氨酶升高占44.12%，遠(yuǎn)低于安徽調(diào)查的81%[20]；另外，41.18%患者的嗜酸性粒細(xì)胞比例下降。

利用分子生物學(xué)方法對(duì)發(fā)病地區(qū)捕獲的鼠的脾臟樣本做恙蟲病東方體groEL基因檢測(cè)，陽(yáng)性率為23.08%。對(duì)擴(kuò)增到的9株恙蟲病東方體groEL基因片段做序列分析，發(fā)現(xiàn)YSP20等8株與泰國(guó)UT213和UT221、日本SH205、中國(guó)浙江Zhou/2012和Jin/2012株遺傳進(jìn)化關(guān)系最密切(同源性均為100%)，而與Karp(M31887)和Kato(JX188393)遺傳進(jìn)化關(guān)系稍遠(yuǎn)(同源性均為99.7%)。文獻(xiàn)報(bào)告泰國(guó)UT213、UT221株和日本SH205株為Karp型[4,21-22]，因此推斷本次檢測(cè)到的8株恙蟲病東方體也可能屬Karp型。本次檢測(cè)到的另一株(YSP30)與日本HSB1、FAR1、UAP4、UAP1株的遺傳進(jìn)化關(guān)系最密切(同源性均為100%)，文獻(xiàn)報(bào)告這些日本株為Saitama型[4,22-23]，因此YSP30也可能屬Saitama型。本次研究首次報(bào)告永善縣可能存在Karp型和Saitama型恙蟲病東方體。groEL為編碼恙蟲病東方體58 kD蛋白抗原的保守基因，其常作為恙蟲病東方體檢測(cè)的靶基因，而較少用于菌株的基因分型，因此本次檢測(cè)到9株恙蟲病東方體的基因型別尚有待于進(jìn)一步確認(rèn)。

該次調(diào)查地為山區(qū)，村落較為分散，居住區(qū)被花椒地、水果地等農(nóng)耕地包圍，在這些發(fā)病地區(qū)采用鼠夾誘捕法對(duì)恙蟲病宿主動(dòng)物鼠類進(jìn)行調(diào)查，所捕鼠類均為黃胸鼠，以往在云南北部金沙江流域和云南部分地區(qū)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)黃胸鼠為優(yōu)勢(shì)鼠種[8，24]。本次調(diào)查的恙蟲病患者居住的院落周圍均有雜草，82.36%以上的患者家中可見鼠類活動(dòng)，其有利于恙蟲病的傳播。目前，當(dāng)?shù)仨οx病的特異性診斷手段缺乏，恙蟲病的診斷多依賴臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，因此漏診、誤診較多。本次發(fā)現(xiàn)恙蟲病患者身體焦痂或潰瘍的比例較高，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的高度重視，注意對(duì)發(fā)熱患者的身體檢查。本次通過(guò)血清學(xué)和分子生物學(xué)方法證實(shí)了永善地區(qū)存在恙蟲病疫源地，應(yīng)對(duì)該地區(qū)進(jìn)行恙蟲病的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和防制。

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