，，，，　

人腺病毒于1953年首次從手術(shù)切除的兒童腺體和扁桃體內(nèi)分離、鑒定，可感染呼吸道、泌尿生殖道及眼角結(jié)膜等多種粘膜組織，引起多種疾病甚至死亡[1]。目前腺病毒已有A-G共7種68個(gè)腺病毒型別。其中B組人3、7、11、14、55和E組4型腺病毒是引起重癥致死性肺炎的主要病原體[2]。由于人腺病毒具有嚴(yán)格的宿主專一性，在常用的模型動(dòng)物體內(nèi)并不感染和復(fù)制，目前國(guó)內(nèi)外仍無(wú)其疾病動(dòng)物模型，因此人B組腺病毒感染相關(guān)的致病機(jī)制，尤其是致重癥機(jī)制，以及不同型病毒間的重組機(jī)制等仍不清楚，亟待研究。

中緬樹(shù)鼩屬哺乳綱，有胎盤(pán)類(lèi)，攀鼩目，樹(shù)鼩科，我國(guó)云南、廣西、廣東、海南島均有分布。樹(shù)鼩與靈長(zhǎng)類(lèi)親緣關(guān)系接近，其解剖結(jié)構(gòu)、生化代謝及基因組方面與人具有較高的相似度，遠(yuǎn)高于鼠、犬、豬等常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因此被認(rèn)為是靈長(zhǎng)類(lèi)最親密的近親[3]。中國(guó)對(duì)樹(shù)鼩的研究早見(jiàn)于教研學(xué)和動(dòng)物學(xué)方面，1975年首先進(jìn)行醫(yī)學(xué)上的嘗試，用于代替恒河猴作為小兒麻痹方面的實(shí)驗(yàn)。近年來(lái)，昆明動(dòng)物研究所對(duì)樹(shù)鼩進(jìn)行了全基因組測(cè)定和解析工作，為樹(shù)鼩應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)方面提供了理論依據(jù)[4]。陳元鼎等人從樹(shù)鼩糞便中檢出具有低滴度的凝聚人O型、B型紅細(xì)胞的腺病毒，但至今仍未確定樹(shù)鼩易感人源腺病毒[5]。鑒于樹(shù)鼩已證實(shí)可感染多種人源病毒，如多種肝炎、輪狀、皰疹、棒狀、副粘[6-8]，而且人腺病毒研究正困于缺乏合適的動(dòng)物模型，將樹(shù)鼩應(yīng)用于人腺病毒動(dòng)物模型的建立是一個(gè)良好的研究方向。

為了探討樹(shù)鼩存在自然感染人腺病毒的可能性及分型，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定樹(shù)鼩血清對(duì)B組人Ad3、Ad7、Ad14、Ad55和E組人Ad4的中和效價(jià)水平，進(jìn)而為后續(xù)探索人腺病毒的樹(shù)鼩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑻峁┮罁?jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本采集樹(shù)鼩購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各半，年齡均>6月齡，于P2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室恢復(fù)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。于樹(shù)鼩腿靜脈處采集0.5 mL無(wú)抗凝血，采集后對(duì)待測(cè)血液標(biāo)本編號(hào)，共34份樣本。將血液標(biāo)本在4 ℃冰箱內(nèi)靜置1 h，3 500 r/min離心5 min，收集血清，-80 ℃保存。

1.2病毒和細(xì)胞系人293細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。實(shí)驗(yàn)中使用的人腺病毒Ad3(GenBank：DQ099432)、Ad4(GenBank：KF006344)為本實(shí)驗(yàn)室分離和保存；Ad7(GenBank：JX625134.1)為重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院惠贈(zèng)；Ad14(GenBank：JQ824845.1)為南方醫(yī)科大學(xué)張其威教授惠贈(zèng)；Ad55(GenBank：KF911353.1)為中國(guó)科學(xué)院生物醫(yī)藥與健康研究院陳凌研究員惠贈(zèng)。病毒在293細(xì)胞增殖，并經(jīng)氯化銫密度梯度離心法純化，測(cè)定TCID50，-80 ℃保存。

1.3試劑PBS、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、100×細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素、鏈霉素、0.25%含EDTA胰酶購(gòu)自GIBCO公司。42.23%和22.39%氯化銫溶液(pH=8.0)為自行配置。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1病毒微量血清中和試驗(yàn)參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS214-2008，附錄B：微量中和試驗(yàn)操作步驟)和相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，采用固定病毒稀釋血清的方法進(jìn)行。待測(cè)血清標(biāo)本56 ℃滅活30 min，以除去可能存在的非特異反應(yīng)物。滅活后血清標(biāo)本40 μL用DMEM從1∶16開(kāi)始作倍比稀釋(從24-210)，即所產(chǎn)生的稀釋倍數(shù)為1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024。根據(jù)所測(cè)滴度，用病毒維持液(含2%血清的DMEM)將病毒稀釋為200 TCID50。取稀釋好的待測(cè)血清及陽(yáng)性血清與病毒稀釋液等量混合(病毒稀釋液終濃度為100 TCID50)。設(shè)定細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照組，將陰性對(duì)照混合液、陽(yáng)性對(duì)照病毒混合液、血清對(duì)照混合液、待測(cè)血清病毒混合液及病毒工作滴度檢查混合液置于37 ℃水浴作用1 h。最后接種至前1 d預(yù)先鋪滿239細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2濕溫培養(yǎng)箱孵育l h，棄去接種物，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，讀取結(jié)果。

以病毒對(duì)照組為對(duì)照，待檢樣品可保護(hù)50%細(xì)胞的為陽(yáng)性樣品，其保護(hù)50%細(xì)胞的最高稀釋度為該樣品的中和效價(jià)。

1.4.2數(shù)據(jù)處理計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)描述給出頻數(shù)和百分比。SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，F(xiàn)isher確切概率法檢驗(yàn)血清中和抗體等級(jí)分布，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.15種腺病毒血清抗體陽(yáng)性樹(shù)鼩情況中和抗體出現(xiàn)于病毒感染的較早期，在體內(nèi)的維持時(shí)間較長(zhǎng)，動(dòng)物體內(nèi)中和抗體水平的高低，可顯示動(dòng)物抵抗病毒的能力，作為判斷動(dòng)物是否感染過(guò)該種病毒的指標(biāo)。結(jié)果顯示，共有21份樹(shù)鼩血清對(duì)5種主要流行的人腺病毒中的一種或多種具有中和作用，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，其中Ad14中和抗體的檢出陽(yáng)性率最高，為55.88%(19/34)，Ad3和Ad55的陽(yáng)性率也較高，分別為47.06%(16/34)和29.71%(10/34)，見(jiàn)表1。21份陽(yáng)性樣品中，有6份為單價(jià)抗血清，14份為多價(jià)血清，見(jiàn)表2。

2.2樹(shù)鼩抗血清樣本中和效價(jià)水平21份樹(shù)鼩陽(yáng)性抗血清根據(jù)抗體種類(lèi)及水平排序，見(jiàn)表3。陽(yáng)性血清主要表現(xiàn)為Ad3、Ad14和Ad55的混合型多價(jià)抗血清。Fisher確切概率法檢驗(yàn)血清中5種型別的中和抗體水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.05)，其中Ad3與Ad4、Ad4與Ad14、Ad7與Ad14的中和效價(jià)等級(jí)構(gòu)成具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.005)，中和Ad3與Ad14的抗血清效價(jià)較高，見(jiàn)圖1。

表1樹(shù)鼩抗血清中不同型別人腺病毒中和抗體陽(yáng)性率
Tab.1Positive rate of different type adenovirus antibody in tree shrews antisera

病毒型別Virustype陽(yáng)性數(shù)(份)Samplesize陽(yáng)性率(%)PositiverateAd31647．06Ad438．82Ad7514．71Ad141955．88Ad551029．71

表2樹(shù)鼩中不同血清型中和抗體混合情況
Tab.2Mixture of different type adenovirus antibody in tree shrews antisera

中和抗體混合種類(lèi)Numberofmixtures例數(shù)Samplesize百分比(%)Percentage01338．241617．652514．713411．764514．71512．94

表321份樹(shù)鼩陽(yáng)性抗血清樣本的中和效價(jià)(1∶χ)
Tab.3Neutralizing titer of 21 positive serum samples

No．Ad3Ad4Ad7Ad14Ad55110246464256128251216-128323102432-32324256-12832325512-16128326128-16326471024--128328256--322569128--64321032--16161132--16-1232--16-1332--16-1432--64-1532--16-16128----17--16--18---16-19---16-20---16-21---16-

圖1　不同型別的血清中和效價(jià)分布Fig.1　Neutralizing titer statistics of positivesamples

3　討　論

有研究報(bào)道以棉鼠、倉(cāng)鼠、CBA小鼠、FVB/n小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立人腺病毒感染動(dòng)物模型，但大部分是基于人5型腺病毒的研究，很少見(jiàn)其它型別的人腺病毒感染動(dòng)物模型研究報(bào)道[9-13]。人5型腺病毒大劑量時(shí)可以感染這些動(dòng)物模型并引起肺炎，但多表現(xiàn)出自限性，病毒在幾天內(nèi)即被清除干凈。相對(duì)于人5型、2型等C組腺病毒感染，人3型、7型、11型等B組腺病毒感染常導(dǎo)致更嚴(yán)重的肺炎，也可能并發(fā)心肌炎、腎炎等[14]。因?yàn)?、7型等B組腺病毒感染的受體(橋粒芯蛋白-2，DSG-2)與5型腺病毒(CAR)不同，具有不同的組織嗜性[15]，所以這些用于人5型腺病毒研究的動(dòng)物模型可能不適合其它型別腺病毒感染研究，人3型、7型、11型、21型、55型等相關(guān)型別的腺病毒感染動(dòng)物模型還需要系統(tǒng)性的研究。本研究小組前期也利用人3型、4型和55型腺病毒對(duì)小鼠、裸鼠、金黃地鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行了攻毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)病毒并不在細(xì)胞中復(fù)制增殖，感染動(dòng)物后呈一過(guò)性感染，動(dòng)物無(wú)明顯癥狀表現(xiàn)，表明上述動(dòng)物不適合作為人B組腺病毒的感染動(dòng)物模型。

樹(shù)鼩作為一種新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在當(dāng)今醫(yī)學(xué)生物學(xué)(特別是病毒學(xué))研究中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。韓建保等人用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)272份樹(shù)鼩血清中人腺病毒IgG抗體，結(jié)果無(wú)陽(yáng)性樣品[16]。在本研究中，我們采用微量中和實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)測(cè)定樹(shù)鼩血清中的人腺病毒抗體，該方法是檢測(cè)宿主過(guò)往感染史的經(jīng)典方法，與常用的酶聯(lián)免疫法等檢測(cè)方法相比更具有優(yōu)勢(shì)：1)特異性更強(qiáng)，不存在交叉反應(yīng)。微量中和實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)血清中的抗人腺病毒中和抗體，是目前仍在沿用的腺病毒血清型分型法的標(biāo)準(zhǔn)方法，各型別之間無(wú)交叉中和反應(yīng)；而ELISA法檢測(cè)對(duì)象是血清中存在的多克隆抗體，在動(dòng)物腺病毒和人腺病毒之間可能存在交叉反應(yīng)，影響結(jié)果的特異性。2)準(zhǔn)確性更高，可用于病毒分型，明確樹(shù)鼩過(guò)往感染的人腺病毒型別，并可進(jìn)一步明確同一動(dòng)物多次感染不同型別病毒的感染史。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)34份樹(shù)鼩抗血清樣本進(jìn)行5種腺病毒的中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示21份樣本顯陽(yáng)性，樹(shù)鼩血清大部分為多價(jià)抗血清，主要表現(xiàn)為和Ad3、Ad14和Ad55混合型多價(jià)抗血清。我國(guó)時(shí)有B組人腺病毒疫情暴發(fā)，血清型以3、7型為主，而新發(fā)致急性呼吸道疾病的14型和55型自首次暴發(fā)后每年均有新增個(gè)案，且疾病程度嚴(yán)重[2,11,17-24]。主要流行型Ad3和近年來(lái)在人群中新發(fā)的Ad14和在樹(shù)鼩血清中的中和抗體檢出率和效價(jià)較Ad55和Ad7的高，E組Ad4的陽(yáng)性率和中和效價(jià)較低，提示人腺病毒在樹(shù)鼩中的流行情況與在人群中暴發(fā)情況有著相關(guān)性。樹(shù)鼩種群中存在人腺病毒流行，是潛在的人腺病毒動(dòng)物模型候選，以樹(shù)鼩為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立人腺病毒感染模型具有較大的可能，后續(xù)可深入探討。

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