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產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種在自然界具有廣泛的分布，在土壤、食物、飼料、污水、糞便中均有生長(zhǎng)，是人畜腸道中正常菌群之一[1]。能引起人類食物中毒、相關(guān)性腹瀉和動(dòng)物腹瀉等疾病的重要病原菌。癥狀通常為下痢(帶血腹瀉)與腹痛，偶爾伴隨惡心、嘔吐與發(fā)燒，病發(fā)期通常為10 h～12 h，患者通?？捎?4 h～48 h內(nèi)康復(fù)，絕少引發(fā)致命疾病，但對(duì)于小孩、老人、及免疫力差的人，會(huì)較易出現(xiàn)嚴(yán)重及持續(xù)癥狀[2]?？上г诎拈T地區(qū)公共衛(wèi)生常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目中，除罐頭食物以外，其它食品并沒有進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，有關(guān)此菌的研究資料更是缺乏。因此本研究進(jìn)行此菌的分離鑒定和基因分型調(diào)查，分析食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染情況以及其基因型分布。

1　材料與方法

1.1樣本采集從本澳的傳統(tǒng)市場(chǎng)及超級(jí)市場(chǎng)中購(gòu)買60個(gè)雞腸、30個(gè)新鮮雞及30個(gè)冰鮮雞樣本，總樣本量為120個(gè)。如8 h內(nèi)不能進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)以無菌操作稱取25 g樣本加入等量緩沖甘油-氯化鈉溶液，并盡快置于-80 ℃低溫冰箱中冷凍保存[3]。

1.2菌株陽性菌株：產(chǎn)氣莢膜梭菌A型(NCTC 8327)由澳門理工學(xué)院高等衛(wèi)生學(xué)校保存，產(chǎn)氣莢膜梭菌B型(NCTC 13110)、產(chǎn)氣莢膜梭菌C型(NCTC 8081)、產(chǎn)氣莢膜梭菌E型(NCTC 8084)等菌購(gòu)自英國(guó)公共健康實(shí)驗(yàn)中心國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)。 陰性菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希氏菌ATCC 25922、糞腸球菌標(biāo)ATCC 29212、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、化膿性鏈球菌 ATCC 19615、普通變形桿菌ATCC 13315、蠟樣芽孢桿菌ATCC 11778等菌由澳門理工學(xué)院高等衛(wèi)生學(xué)校保存。

1.3培養(yǎng)基和試劑甘油-氯化鈉溶液購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，蛋白胨水、蛋白胨—亞硫酸鹽—環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基(TSC)、D-環(huán)絲氨酸購(gòu)自O(shè)XOID公司，血培養(yǎng)基(5%羊血)購(gòu)自BIOMERIEUX公司，酸性磷酸酶試劑購(gòu)自SIGMA公司，multiplex PCR試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。

1.4細(xì)菌分離與鑒定采集樣品的處理均按國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行[3]。吸取10-1的稀釋檢液1 mL，然后加入9 mL TSC，制成10-2的檢測(cè)樣本。再制成10-3的檢測(cè)樣本。在42 ℃經(jīng)雙套管法培養(yǎng)6 h～8 h后，觀察是否有黑色菌落生成，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)多少黑色菌落選取5個(gè)菌落再接種在5%羊血培養(yǎng)基，經(jīng)24 h厭氧培養(yǎng)，觀察菌落是否帶有雙溶血環(huán)，再挑選該菌落選已滴加酸性磷酸酶試劑的濾紙中涂開，等待2～3 min，呈現(xiàn)紫色視為產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性。

1.5DNA模板的制備利用經(jīng)生化鑒定后菌株加入100 μL無菌水制作菌液，于沸水浴中加熱10 min后，用1 630×g離心10 min后提取上清液。

1.6鑒定分離菌株的基因分型

1.6.1multiplex PCR引物購(gòu)自Ivitrogen公司的6對(duì)引物，引物序列見表1。

1.6.2multiplex PCR反應(yīng)體積為25 μL，包括：2× PCR Mix 12.5 μL；引物混合物2.5 μL；樣本DNA 2 μL；蒸餾水補(bǔ)足至25 μL?；靹蚝箝_始進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 延伸7 min[4]。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用100by-III DNA標(biāo)志物作為分子量參照，在1.8%瓊脂糖凝膠中 100 V電泳，80 min，在ChemiDoc 影像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.6.3multiplex PCR專一性測(cè)試按照1.5和1.6.2的方法，對(duì)1.2中的陽性菌株與陰性菌株進(jìn)行multiplex PCR擴(kuò)增，評(píng)定multiplex PCR的專一性。

2　結(jié)　果

2.1產(chǎn)氣莢膜梭菌分離與生化鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性，短粗的梭狀芽孢桿菌；在TSC中形成黑色菌落；在5%羊血培養(yǎng)基中出現(xiàn)雙溶血環(huán)的特征；在酸性磷酸酶試劑中，呈現(xiàn)紫色。從60個(gè)雞腸樣本中分離得到30株 (50%)；從30個(gè)新鮮雞樣本中分離得到10株 (33.33%)；從30個(gè)冰鮮雞樣本中分離得5株 (16.67%)。

表1擴(kuò)增產(chǎn)氣莢膜梭菌的六種主要毒素基因的引物序列
Tab.1Primer used to amplify six toxin genes of Clostridium perfringens

基因Gene引物序列5′?3′Primersequences5′?3′產(chǎn)物長(zhǎng)度Productsize(bp)參考文獻(xiàn)ReferencecpαGCTAATGTTACTGCCGTTGA324[5]CCTCTGATACATCGTGTAAGcpβ1GCGAATATGCTGAATCATCTA196[5]GCAGGAACATTAGTATATCTTCεtxGCGGTGATATCCATCTATTC655[5]CCACTTACTTGTCCTACTAACιAACTACTCTCAGACAAGACAG446[5]CTTTCCTTCTATTACTATACGcpeGGAGATGGTTGGATATTAGG233[5]GGACCAGCAGTTGTAGATAcpβ2AGATTTTAAATATGATCCTAACC567[6]CAATACCCTTCACCAAATACTC

2.2產(chǎn)氣莢膜梭菌基因分型經(jīng)電泳鑒定，45 株產(chǎn)氣莢膜梭菌均擴(kuò)增出大小約為 324 bp 的特異性條帶，未擴(kuò)增出針對(duì)cpβ1、εtx、ιA、cpe和cpβ2的條帶，說明45株產(chǎn)氣莢膜梭菌均為 A型，見圖1。

1.100 bp DNA Marker；2.Blank；3.C.perfringens NCTC 8327；4.C.perfringens NCTC 3626；5.C.perfringens NCTC 8084；6.C.perfringens NCTC 8081；7-10.Sample Isolates圖1　產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株的mPCR基因分型方法檢測(cè)結(jié)果Fig.1　Multiplex PCR detection of isolated C.perfringens

2.3mPCR專一性測(cè)試4株標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)氣莢膜梭菌均能擴(kuò)增出相應(yīng)毒素基因的片段，大小分別為： NCTC 8327 約為 324 bp；NCTC 13110為 196 bp、324 bp和655 bp；NCTC 8081為196 bp、 233 bp和324 bp；NCTC 8084 為324 bp、446 bp和567 bp。而陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出相應(yīng) 的片段。說明mPCR 的專一性良好，見圖2。

1.100 bp DNA Marker；2.C.perfringens NCTC 8327；3.C.perfringens NCTC 3626；4.Clostridium perfringens NCTC 8084；5.C.perfringens NCTC 8081；6.Blank；7.Escherichia coli ATCC 29213；8.Staphylococcus aureus ATCC 25922；9.Enterococcus faecalis ATCC 29212；10.Salmonella typhimurium ATCC 14028；11.Streptococcus pyogenes ATCC 19615；12.Proteus vulgaris ATCC 13315；13.Bacillus cereus ATCC 1177圖2　mPCR專一性測(cè)試結(jié)果Fig.2　Result of specificity test of multiplex PCR

3　討　論

產(chǎn)氣莢膜梭菌并非動(dòng)物腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，其菌量相對(duì)較少[7]，因此當(dāng)檢出率很高時(shí)，可能是在屠宰過程中的交叉污染，以及處理的衛(wèi)生條件較差所致。本次研究共檢出45株產(chǎn)氣莢膜梭菌(37.5%)，60個(gè)雞腸樣本檢出率占50%，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)普遍高于60%的檢出率相比[8-9]，本研究雞腸樣本的檢出率亦相對(duì)偏低，這可能與本澳在雞只屠宰后會(huì)反復(fù)清洗其內(nèi)臟再出售有關(guān)。30個(gè)新鮮雞 (33.33%)和30個(gè)冰鮮雞樣本(16.67%)中，與鄰近地區(qū)廣州的檢出率68.6%比較[10]，相對(duì)較低；雖然澳門地區(qū)雞只來源于內(nèi)地，預(yù)期結(jié)果與內(nèi)地接近，但檢出率仍較廣州的結(jié)果低，這可能與雞只的屠宰處理過程中較規(guī)范，所引致的污染較低有關(guān)。

在A至E型的產(chǎn)氣莢膜梭菌中，對(duì)人類有致病性只有A型及C型，以A型最為常見，本研究所有分離株均為具有致病性的A型，表示從市面出售的雞腸、新鮮雞及冰鮮雞如沒有徹底煮熟，于進(jìn)食后有出現(xiàn)食物中毒的風(fēng)險(xiǎn)。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比較，新鮮雞的檢出率較冰鮮雞多出一倍，說明在冰鮮雞的屠宰及冷卻等處理過程中所造成的污染相對(duì)較少。由于澳門地區(qū)最近已經(jīng)全面以冰鮮雞代替新鮮雞供應(yīng)澳門地區(qū)市場(chǎng)，當(dāng)中除了禽流感為考慮因素外，其它的致病菌亦不能忽視，本次研究正好為產(chǎn)氣莢膜梭菌，在新鮮雞及冰鮮雞上的污染程度所致的公共衛(wèi)生問題提供了參考數(shù)據(jù)。

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