尤　雙， 曹　洋， 李村院， 魏軍昌， 李曉悅， 張翔宇， 姚　洋， 胡圣偉， 倪　偉

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

基因編輯技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為研究基因功能的工具，在生物醫(yī)學(xué)研究和農(nóng)業(yè)上改善動(dòng)物特性，從而產(chǎn)生基因修飾動(dòng)物模型。CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括1個(gè)單鏈導(dǎo)向RNA(sgRNA)和1個(gè)人類的優(yōu)化密碼子Cas9核酸酶，通過非同源末端連接(簡(jiǎn)稱NHEJ)能夠誘導(dǎo)靶突變。

家兔在生物分子研究中是一個(gè)很有發(fā)展前景的動(dòng)物模型，它們與人類在生理學(xué)和解剖學(xué)等方面比小鼠和大鼠更相似，而且與豬和猴[1]相比，飼養(yǎng)費(fèi)用低、妊娠時(shí)間短[2]。因此，選擇用基因敲除的兔作為疾病動(dòng)物模型，為探索和研究人類疾病機(jī)制、治療性藥物篩選提供了重要研究工具。現(xiàn)有研究顯示，基因敲除家兔是研究肥厚型心肌病、脂類代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的極佳模型[3-6]。Myostatin(簡(jiǎn)稱MSTN)又稱GDF-8，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超級(jí)族(transforming growth factor bata，簡(jiǎn)稱TGF-β)。它用于反向調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)[7-8]。已經(jīng)有報(bào)道表明，MSTN的自然突變?cè)谂?、綿羊[9-10]身上造成肌肉的過度生長(zhǎng)。增加肌肉組織的雙肌表型特征在MSTN 敲除綿羊、豬和狗[11-13]身上也已經(jīng)獲得，從而鼓勵(lì)我們研究MSTN敲除兔，用于研究肌肉的發(fā)展，以便將來在農(nóng)業(yè)上提升動(dòng)物特性。

目前，細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因最常用的高效方法有脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染和電穿孔法。電穿孔是外加電場(chǎng)造成細(xì)胞質(zhì)膜暫時(shí)性結(jié)構(gòu)改變形成可恢復(fù)空隙時(shí)，將外源基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的過程，此方法操作具有簡(jiǎn)單、快捷、可重復(fù)性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)[14]。

本試驗(yàn)通過使用 Lonza Nucleofector 設(shè)備，對(duì)家兔的成纖維細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)，驗(yàn)證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯的高效性，為后續(xù)獲得MSTN敲除兔打下基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　主要試劑及儀器

Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa)，質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)(TIANGEN)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(普通離心柱型)(TIANGEN)，BbsⅠ(NEB)，DL10000 DNA marker、DL2000 DNA marker[寶生物工程(大連)有限公司]，感受態(tài)菌DH5α(實(shí)驗(yàn)室自制)，引物合成和測(cè)序由Invitrogen公司完成。青霉素-鏈霉素溶液，DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，P3 Primary cell 4D-Nucleofector×Kit L(24RCT)(Lonza 公司，德國)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽提取試劑盒(TIANGEN)；Lonza 4D-Nucleofector 電轉(zhuǎn)儀(Lonza 公司，德國)，冰箱(海爾集團(tuán)，中國)，移液器(Eppendorf 公司，德國)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo 公司，日本)，超凈工作臺(tái)(Baker 公司，中國)，凍存盒(Nalgene，美國)，0.22μm 微孔濾膜(Millipore 公司，美國)，倒置相差顯微鏡(Nikon，德國)。

1.2　方法

1.2.1sgRNA設(shè)計(jì)和合成根據(jù)GenBank中公布的兔MSTN基因序列(序列號(hào)：AM931157.1)，利用CRISPR/Cas9在線設(shè)計(jì)工具(http：//tools.genomeenging.org)設(shè)計(jì)sgRNA。選擇DNA的正義鏈或反義鏈的序列GGN18NGG或GGN17NGG作為靶位點(diǎn)。引物見表1，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行化學(xué)合成。

1.2.2Cas9/gRNA表達(dá)載體的構(gòu)建將sgRNA上下游引物配制為100 μmol/L濃度，各取10 μL混合，于95 ℃水浴 5 min 后，關(guān)閉水浴鍋，在水浴中自然緩慢降溫至室溫退火。用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ(NEB)切割PX330載體，使其線性化。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒

表1　PCR反應(yīng)引物

(TIANGEN)回收CRISPR/Cas9線性化載體。線性化載體與退火的sgRNA用T4連接酶于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)菌中，2 d后挑取單克隆，保菌并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.3兔成纖維細(xì)胞的分離及培養(yǎng)選擇懷孕約15～20 d的新西蘭母兔處死，取出子宮，放在培養(yǎng)皿中。無菌條件下取出胎兒，剪去頭、尾、四肢并去除內(nèi)臟，在超凈臺(tái)上，用含 100 mg/L 青霉素和 100 mg/L鏈霉素的無菌磷酸緩沖鹽溶液(簡(jiǎn)稱PBS)將上述預(yù)處理的部分組織漂洗 3～5遍，在無菌培養(yǎng)皿中用眼科剪剪切成約1 mm3的小塊，采用組織塊培養(yǎng)法，獲得原代成纖維細(xì)胞。然后進(jìn)行常規(guī)的原代和傳代培養(yǎng)，或冷凍保存或用于轉(zhuǎn)染。

兔成纖維細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)液(含15%胎牛血清)，37 ℃、5.0% CO2飽和濕度培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心 8 min。洗滌收集細(xì)胞，用于電轉(zhuǎn)染和細(xì)胞基因組檢測(cè)。

1.2.4電轉(zhuǎn)染按照Lonza Nucleofector電轉(zhuǎn)儀操作說明，82 μL S1溶液和18 μL S2溶液。收集1.0×106個(gè)細(xì)胞，加入5 μg除內(nèi)毒素的Cas9/gRNA質(zhì)粒，用100 μL電轉(zhuǎn)液混合懸浮細(xì)胞，混勻后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中。選擇小鼠胚胎成纖維細(xì)胞程序EH-100，對(duì)兔胚胎成纖維細(xì)胞實(shí)施電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后靜置10 min，將電轉(zhuǎn)細(xì)胞轉(zhuǎn)入提前溫育的20% FBS培養(yǎng)液的6孔板中，37 ℃，5.0% CO2飽和濕度培養(yǎng)，5～6 h后換液。轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)放于30 ℃、5.0% CO2飽和濕度培養(yǎng)，48 h后，再于37 ℃培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組。

2　結(jié)果與分析

2.1　sgRNA設(shè)計(jì)

利用CRISPR/Cas9在線設(shè)計(jì)工具(http：//tools.genomeenging.org)，針對(duì)家兔MSTN基因的CDs區(qū)設(shè)計(jì)了sgRNA(圖1)。MSTN基因外顯子3為生物活性區(qū)。為了失活MSTN外顯子3，選擇靶位點(diǎn)位于MSTN基因第二外顯子區(qū)的sgRNA用于后續(xù)研究。

2.2　Cas9/gRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

通過質(zhì)粒小提試劑盒，提取PX330質(zhì)粒。BbsⅠ酶切后，由圖2可知，酶切后的PX330為單一條帶，而對(duì)照質(zhì)粒為2條條帶，表明酶切成功。切膠回收后與gDNA按一定比例，16 ℃ 水浴過夜連接。將連接產(chǎn)物通過熱激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入感受態(tài)菌DH5α，小量擴(kuò)增。2 d后挑單克隆菌落，過夜搖菌擴(kuò)增，保菌并送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，sgRNA成功連入PX330質(zhì)粒(圖3)，Cas9/gRNA表達(dá)質(zhì)粒pCas9/gRNA構(gòu)建成功。

2.3　EGFP表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率

由于CRISPR/Cas質(zhì)粒沒有熒光表達(dá)信號(hào)，于是將EGFP質(zhì)粒與pCas9/gRNA質(zhì)粒共5 μg轉(zhuǎn)染家兔成纖維細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)熒光，表明電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)成功。核轉(zhuǎn)染24 h后，可見綠色熒光表達(dá)，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，活力良好(圖4)。

2.4　Cas9/gRNA敲除效率

核轉(zhuǎn)染3d后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總DNA，通過PCR擴(kuò)增出目的條帶，連接pMD19-T載體，隨機(jī)挑取13個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序。由圖5可知，3個(gè)克隆中的MSTN基因發(fā)生了突變，其中2個(gè)克隆出現(xiàn)了相同類型的堿基缺失(CA堿基缺失)，另一個(gè)出現(xiàn)了單堿基突變(A突變?yōu)镚)。經(jīng)計(jì)算pCas9/gRNA載體的基因突變效率為23%。

3　討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是發(fā)展最為迅猛的基因編輯技術(shù)，它不僅效率高、適應(yīng)面廣，且操作簡(jiǎn)單、周期相對(duì)較短。越來越多地取代ES打靶技術(shù)基因組特定位點(diǎn)的修飾，這讓基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用和普及成為可能。近年來，相當(dāng)多的報(bào)道提到應(yīng)用CRISPR/Cas9方法在不同物種中實(shí)現(xiàn)了基因敲除、插入和突變。

原則上，所有個(gè)體都可作為組織細(xì)胞的供體，但同樣細(xì)胞來自幼年個(gè)體比來自老年個(gè)體的易于培養(yǎng)；來自同一個(gè)體的組織，分化程度低的組織細(xì)胞比分化程度高的容易培養(yǎng)。因此，在試驗(yàn)取材時(shí)，本試驗(yàn)選用了 15～20 日齡的家兔胚胎作為成纖維細(xì)胞的供體。

電轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)要求比較嚴(yán)格，細(xì)胞傳代最好在 6 代以內(nèi)且生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞密度達(dá)到 70%～80%融合時(shí)最適宜做電轉(zhuǎn)染[15]，細(xì)胞密度太高，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的降低。因此，在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，選用的是第三代細(xì)胞，并且細(xì)胞密度達(dá)到約80%開始進(jìn)行試驗(yàn)。

本試驗(yàn)通過使用 Lonza Nucleofector 設(shè)備，對(duì)家兔的成纖維細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)，將EGFP質(zhì)粒與pCas9/gRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染家兔成纖維細(xì)胞，從而驗(yàn)證筆者構(gòu)建的pCas9/gRNA質(zhì)粒在細(xì)胞水平上對(duì)MSTN的敲除效率，筆者初步驗(yàn)證Cas9/gRNA的敲除效率約為23%，為下一步進(jìn)行胚胎顯微注射和體細(xì)胞克隆技術(shù)制備MSTN基因敲除家兔奠定基礎(chǔ)。

在本試驗(yàn)中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒對(duì)家兔成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，因使用的核轉(zhuǎn)染儀中沒有專門針對(duì)轉(zhuǎn)染家兔的成纖維細(xì)胞設(shè)定的程序，所以選用綿羊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序進(jìn)行轉(zhuǎn)染，可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。

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