邵洋，胡延平，劉勇

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1. 檢驗(yàn)科；2. 血液研究室，沈陽(yáng) 110004）

慢性淋巴細(xì)胞白血病 （chronic lymphocytic leukemia，CLL） 是成熟樣B淋巴細(xì)胞在外周血、骨髓、淋巴結(jié)和脾臟大量蓄積為特征的低度惡性腫瘤。CLL在歐美較為常見(jiàn)，而在我國(guó)相對(duì)少見(jiàn)。目前對(duì)CLL的診斷主要依賴于WHO標(biāo)準(zhǔn)［1］，依據(jù)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血涂片免疫表型等對(duì)CLL進(jìn)行診斷，目前CLL治療參考NCCN指南［2］，需要根據(jù)患者年齡、細(xì)胞遺傳學(xué)等分層治療，預(yù)后判斷參考RAI和BINET標(biāo)準(zhǔn)［3-4］，這兩個(gè)傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)主要依賴于體檢及血細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)判斷預(yù)后，并不能充分滿足患者需要。近年來(lái)一些分子生物學(xué)指標(biāo) （IGHV、ZAP70、17p-和11q-等） 也參與CLL的診斷治療及預(yù)后判斷［5］。為彌補(bǔ)缺陷，CLL-IPI（CLL international prognostic index） 積分系統(tǒng)納入了TP53缺失/突變、IGHV突變、血清β2-微球蛋白、臨床分期和年齡5個(gè)指標(biāo)輔助CLL患者的預(yù)后判斷［6］。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncR-NA） 是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子，它可在多層面上 （表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等） 調(diào)控基因的表達(dá)［7］。非編碼RNA的異常表達(dá)可以輔助CLL的診斷及預(yù)后分層，已有研究證明，多種miRNA及LncRNA在CLL的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，miR-155提高BCR受體的敏感性，其高表達(dá)預(yù)示著較差的預(yù)后［8］，而與之相反，miR-150降低BCR受體的敏感性［9］，同時(shí)，也有多種lncRNA的下調(diào)被認(rèn)為參與腫瘤的生成，包括HOTAIR、MALAT1和SChLAP1等［10］。本研究前期通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)篩選CLL患者中相對(duì)于健康人B淋巴細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的異常表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超過(guò)20 000種lncRNA存在異常表達(dá)，其中RP5-180C18.1存在顯著上調(diào) （P＜ 0.001） ，提示RP5-180C18.1可能在CLL的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。本研究分析RP5-180C18.1的表達(dá)，探討其在CLL診斷及預(yù)后判斷上的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2006年1月至2017年1月本院血液科就診的初診CLL患者，采用樣本庫(kù)中留存的臨床廢棄骨髓樣本60例，其中男性27例，女性33例，中位年齡65歲。并采自30例造血干細(xì)胞移植供者骨髓液為健康對(duì)照。所有患者經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)綜合確診，實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)見(jiàn)表1，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn) （No. 2016PS352K） 。根據(jù)相關(guān)分子生物學(xué)指標(biāo)，分別根據(jù)IGHV突變、CD38及ZAP70對(duì)CLL患者進(jìn)行分組比較。并對(duì)60例CLL患者進(jìn)行了隨訪。

表1 CLL患者實(shí)驗(yàn)室特征Tab.1 Laboratory features of the chronic lymphocytic leukemia （CLL） and control groups

1.2 方法

1.2.1 試劑及引物：淋巴細(xì)胞分離液Lymphoprep（中國(guó)達(dá)科公司） ，逆轉(zhuǎn)錄采用RrimeScript RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司） 。實(shí)時(shí)采用SYBR Green試劑盒（日本TaKaRa公司） 。引物為RP5-180C18.1，F(xiàn)：GCAGCGTCCAGAGGCTGG，R：GGCAGCGAGGATGCTGAACC；TBP，F(xiàn)：CCACGGTG AATCTGTGCT，R：GGAGTCGTCCTCGCTCTT。

1.2.2 qPCR檢測(cè)：采用淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，然后Trizol-氯仿方法提取細(xì)胞總RNA，Oligo dT法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以管家基因TBP為內(nèi)參，同時(shí)進(jìn)行RP5-180C18.1和TBP的實(shí)時(shí)反應(yīng)。實(shí)時(shí)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，得出Ct均值，以正常人為對(duì)照，應(yīng)用ΔΔCt相對(duì)定量法分析RP5-180C18.1表達(dá)水平的差異。ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，ΔCt=Ct RP5-180C18.1-Ct TBP，2-ΔΔCt即為基因表達(dá)差異的倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，預(yù)后分析采用log-rank檢驗(yàn)。P＜ 0.05 （雙向） 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RP5-180C18.1在不同CLL表型中的表達(dá)

結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組 （1.894±0.62） 比較，RP5-180C18.1在CLL患者 （12.93±2.98） 表達(dá)較高 （P=0.013） 。與突變型CLL患者 （0.505±0.07） 比較，IGHV野生型CLL患者 （4.682±1.08） RP5-180C18.1表達(dá)高 （P=0.023） ；與 ZAP70 高表達(dá)CLL患者 （0.262±0.04） 比較，ZAP70低表達(dá)CLL患者 （1.728±0.42） RP5-180C18.1表達(dá)較高 （P= 0.002） ；CD38低表達(dá) （1.162±0.31） 與高表達(dá)（2.183±0.67） CLL患者RP5-180C18.1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P= 0.206） 。

2.2 RP5-180C18.1表達(dá)與CLL分型相關(guān)分析

將60例CLL樣本根據(jù)RP5-180C18.1相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù) （2.863） 進(jìn)行分組［RP5-180C18.1低表達(dá)組 （＜2.863） 和RP5-180C18.1高表達(dá)組 （＞2.863）］，分析CLL患者臨床特征、分型與RP5-180C18.1表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果顯示，RP5-180C18.1表達(dá)與CLL患者性別、年齡、血紅蛋白含量及幼稚淋巴細(xì)胞比例無(wú)關(guān)（P分別為 0.604、0.128、0.133、0.058） ；RP5-180C18.1高表達(dá)組CLL患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)較低 （P＜ 0.001） ，血小板含量較高 （P＜ 0.001） 。根據(jù)分子生物學(xué)特征分組結(jié)果顯示，RP5-180C18.1表達(dá)與CD38表達(dá)無(wú)關(guān)（P= 0.796） ；RP5-180C18.1高表達(dá)組CLL患者ZAP70表達(dá)率較高 （P= 0.019） ，野生型IGHV比例較高 （P=0.030） 。見(jiàn)表2。

表2 RP5-180C18.1表達(dá)與CLL患者臨床特征、分型的相關(guān)分析Tab.2 Correlation analysis of RP5-180C18.1 expression and the clinical features and phenotyping of patients with chronic lymphocytic leukemia

2.3 RP5-180C18.1表達(dá)與CLL患者預(yù)后相關(guān)分析

對(duì)60例CLL患者隨訪結(jié)果顯示，中位總生存期 （overall survival，OS） 93個(gè)月，中位無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS） 75個(gè)月。RP5-180C18.1低表達(dá)組中位OS 98個(gè)月，RP5-180C18.1高表達(dá)組中位OS 39個(gè)月，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P= 0.048） ，見(jiàn)圖1A，RP5-180C18.1高表達(dá)CLL患者OS更短。如圖1B所示，RP5-180C18.1低表達(dá)組中位PFS 81個(gè)月，RP5-180C18.1高表達(dá)組中位PFS 25個(gè)月，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P= 0.041） ，RP5-180C18.1高表達(dá)的CLL患者PFS更短。RP5-180C18.1高表達(dá)組預(yù)后相對(duì)于RP5-180C18.1低表達(dá)組更差。

3 討論

圖1 根據(jù)RP5-180C18.1表達(dá)量對(duì)CLL患者進(jìn)行的Kaplan-Meier生存分析結(jié)果Fig.1 Kaplan-Meier survival curves of patients with CLL according to RP5-180C18.1 expression

RP5-180C18.1位于1號(hào)染色體，編碼一段596 bp的轉(zhuǎn)錄本，基因 ID為ENST00000413901，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA RP5-180C18.1在CLL不同表型中存在差異性表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)其在CLL診斷及預(yù)后判斷具有輔助作用。結(jié)果顯示RP5-180C18.1在CLL患者中相對(duì)于健康對(duì)照存在高表達(dá)，提示RP5-180C18.1有作為檢測(cè)CLL診斷學(xué)標(biāo)志物的潛力。已有研究證明，lncRNA在腫瘤中存在顯著差異性表達(dá)，可以作為生物標(biāo)志物輔助腫瘤檢測(cè)。有研究［11］證明在患者尿液樣本中檢測(cè)lncRNA PCA3可以比前列腺特異性抗原更敏感更特異診斷前列腺癌。血清中檢測(cè)rp11-445h22.4發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌組織中高表達(dá)，并且具有92%敏感性和74%特異性，顯著優(yōu)于常規(guī)生物標(biāo)志物 （CEA、CA125、CA153、AFP）［12］。另外，在胃癌患者體液樣本中檢測(cè)lncRNA tincr，ccat2，aoc4p，bancr，linc00857， aa174084和H19發(fā)現(xiàn)，這些 lncRNA 可以有效鑒別胃癌患者與健康人，并且可以判斷胃癌發(fā)展的階段［13］。需要注意的是，本研究對(duì)照組設(shè)置相對(duì)于實(shí)驗(yàn)組在參數(shù) （幼稚細(xì)胞比例及血常規(guī)） 上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但這并不違背統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，本研究目的是探索RP5-180C18.1作為CLL生物學(xué)標(biāo)志物的潛力，需要把CLL從健康人中鑒別出來(lái)，因此必須采用健康人群作為對(duì)照，而幼稚細(xì)胞數(shù)及血常規(guī)指標(biāo)正是CLL的常見(jiàn)異常。外周血標(biāo)本來(lái)源便捷，臨床上最理想的檢測(cè)標(biāo)志物采用外周血指標(biāo)，但是因?yàn)闃?biāo)本收集受限，本研究未檢測(cè)外周血RP5-180C18.1含量，本研究骨髓檢測(cè)RP5-180C18.1表達(dá)可靠，同時(shí)期待應(yīng)用于臨床CLL診斷，后續(xù)將進(jìn)一步完善外周血RP5-180C18.1表達(dá)檢測(cè)。

對(duì)CLL患者隨訪分析結(jié)果顯示，RP5-180C18.1高表達(dá)患者具有更差的預(yù)后。研究［14］證明lncRNA在腫瘤預(yù)后判斷起重要作用，lncRNA CCAT2在多種腫瘤 （結(jié)腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌等） 中過(guò)表達(dá)，并且預(yù)示著較差預(yù)后。也有研究［15］認(rèn)為treRNA降低CLL中DNA損傷，其高表達(dá)預(yù)示著較差預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn) RP5-180C18.1在野生型 IGHV和ZAP70高表達(dá)CLL患者中表達(dá)更高，這是否與RP5-180C18.1高表達(dá)CLL患者預(yù)后較差有關(guān)尚未證實(shí)，需進(jìn)一步研究。研究［16］證明IGHV未突變型或ZAP70高表達(dá)CLL患者具有較差預(yù)后，這也從另一方面支持本研究結(jié)果。

綜上所述，lncRNA RP5-180C18.1在CLL中高表達(dá)，與CLL侵襲性表型相關(guān)，并且其高表達(dá)具有較差預(yù)后。今后應(yīng)對(duì)RP5-180C18.1表達(dá)深入研究，為闡明CLL的發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ HALLEK M. Chronic lymphocytic leukemia：2017 update on diagnosis，risk stratification，and treatment ［J］. Am J Hematol，2017，92 （9） ：946-965. DOI：10.1002/ajh.24826.

［2］ WIERDA WG，ZELENETZ AD，GORDON LI，et al. NCCN guidelines insights：chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic leukemia，version 1.2017 ［J］. J Nat Comprehensive Cancer Network，2017，15 （3） ：293-311.

［3］ BINET JL，AUQUIER A，DIGHIERO G，et al. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis ［J］. Cancer，1981，48 （1） ：198-206.

［4］ RAI KR，HAN T. Prognostic factors and clinical staging in chronic lymphocytic leukemia ［J］. Hematology/oncology Clini North Am ，1990，4 （2） ：447-456.

［5］ CLAUS R，LUCAS DM，STILGENBAUER S，et al. Quantitative DNA methylation analysis identifies a single CpG dinucleotide important for ZAP-70 expression and predictive of prognosis in chronic lymphocytic leukemia ［J］. J Clin Oncol，2012，30 （20） ：2483-2491. DOI：10.1200/JCO.2011.39.3090.

［6］ A Clinical Evaluation of the International Lymphoma Study Group Classification of Non-Hodgkin’s Lymphoma. The non-Hodgkin’s lymphoma classification project ［J］. Blood，1997，89 （11） ：3909-3918.

［7］ GUTTMAN M，DONAGHEY J，CAREY BW，et al. lncRNAs act in the circuitry controlling pluripotency and differentiation ［J］. Nature，2011，477 （7364） ：295-300. DOI：10.1038/nature10398.

［8］ GUINN D，RUPPERT AS，MADDOCKS K，et al. miR-155 expression is associated with chemoimmunotherapy outcome and is modulated by Bruton’s tyrosine kinase inhibition with Ibrutinib ［J］. Leukemia，2015，29 （5） ：1210-1213. DOI：10.1038/leu.2014.344

［9］ MRAZ M，CHEN L，RASSENTI LZ，et al. miR-150 influences B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia by regulating expression of GAB1 and FOXP1 ［J］. Blood，2014，124 （1） ：84-95. DOI：10.1182/blood-2013-09-527234.

［10］ PRENSNER JR，IYER MK，SAHU A，et al. The long noncoding RNA SChLAP1 promotes aggressive prostate cancer and antagonizes the SWI/SNF complex ［J］. Nat Genet，2013，45 （11） ：1392-1398.DOI：10.1038/ng.2771.

［11］ TINZL M，MARBERGER M，HORVATH S，et al. DD3PCA3 RNA analysis in urine--a new perspective for detecting prostate cancer ［J］. Eur Urol，2004，46 （2） ：182-186. DOI：10.1016/j.eururo.2004.06.004.

［12］ SHAPPELL SB. Clinical utility of prostate carcinoma molecular diagnostic tests ［J］. Rev Urol，2008，10 （1） ：44-69.

［13］ ZHANG K，SHI H，XI H，et al. Genome-wide lncRNA microarray profiling identifies novel circulating lncRNAs for detection of gastric cancer ［J］. Theranostics，2017，7 （1） ：213-227. DOI：10.7150/thno.16044.

［14］ WANG D，CHEN Z，XU H，et al. Long noncoding RNA CCAT2 as a novel biomaker of metastasis and prognosis in human cancer：a meta-analysis ［J］. Oncotarget，2017，8 （43） ：75664-75674. DOI：10.18632/oncotarget.18161.

［15］ MILLER CR，RUPPERT AS，F(xiàn)OBARE S，et al. The long noncoding RNA，treRNA，decreases DNA damage and is associated with poor response to chemotherapy in chronic lymphocytic leukemia ［J］.Oncotarget，2017，8 （16） ：25942-25954. DOI：10.18632/oncotarget.15401.

［16］ PARIKH SA，STRATI P，TSANG M，et al. Should IGHV status and FISH testing be performed in all CLL patients at diagnosis? A systematic review and meta-analysis ［J］. Blood，2016，127 （14） ：1752-1760. DOI：10.1182/blood-2015-10-620864.