彭華童，吳文藝，張麗婷，林建清，余藝煌，吳春林，黃種心，邱建龍

（1. 福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腫瘤外科，福建 泉州 362000； 2. 解放軍第一八零醫(yī)院內分泌科，福建 泉州 362000； 3. 解放軍第一八零醫(yī)院病理科，福建 泉州 362000）

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌 （thyroid papillary carcinoma，TPC） 是最常見的一種類型，占所有甲狀腺癌的80%～85%。雖然TPC的總體預后較好，但仍有約10%的患者可能死于該?。?］。近年來，國內外的調查結果顯示甲狀腺癌的發(fā)病率呈顯著增加趨勢。然而，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多環(huán)節(jié)、多因素、多階段的復雜過程，甲狀腺癌發(fā)生的原因及機制目前尚不清楚，絕大多數(shù)觀點認為基因突變或表達異常在TPC的發(fā)生中起重要作用。

沉默信息調節(jié)因子2相關酶1 （silent information regulator 2 homolog 1，SIRT1） 是Sirtuins 家族中的一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD+） 的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶［2］，它可使多種蛋白質的賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；?，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著廣泛的生物學功能［3］。HERRANZ等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在磷酸酶和張力蛋白同源物 （phosphatase and tensin homolog，PTEN） 基因缺乏的小鼠甲狀腺癌中，SIRT1蛋白異常升高，原癌基因c-MYC被激活，c-MYC蛋白表達上調。吳文藝等［5-6］研究證實，SIRT1在TPC組織中高表達，可能與TPC的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結轉移有關。

本研究利用脂質體法使SIRT1siRNA轉染體外培養(yǎng)的人TPC細胞株TPC-1，用qRT-PCR方法檢測siRNA的干擾效率，篩選出干擾效率最強的siRNA，并用Western blotting驗證SIRT1蛋白的表達，利用CCK8法、Hoechst染色法、流式細胞儀及β-半乳糖苷酶染色法檢測轉染細胞的增殖抑制率、凋亡、周期與衰老的變化，旨在探討SIRT1沉默對人TPC細胞株TPC-1生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人TPC細胞株TPC-1購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；SIRT1siRNA由Sigma公司設計合成 （表1） ；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素、PBS磷酸鉀緩沖液購自美國Hyclone公司；Trizol、SYBR GREEN qPCR Super Mix購 自 美 國Invitrogen公 司；ImProm-ⅡTMReverse Transcription System、dNTP、Ramdom Primer、M-MLV、DNase、RNasin Ribonuclease Inhibitor購自美國Promega公司；HRP標記的GAPDH內參購自上海康成生物公司；SIRT1一抗購自美國Cell Signaling公司；二抗山羊抗兔 IgG （H+L） ，Mouse/Human ads-HRP、兔抗鼠IgG （H+L） -HRP購自美國Southern Biotech公司；磷酸酶抑制劑、BCA法蛋白含量檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒購自江蘇Keygen公司；RIPA裂解液、一抗稀釋液、細胞衰老 β-半乳糖苷酶染色試劑盒、Hoechst 33258染色液、CCK-8溶液購自上海Beyotime Biotechnology公司；其他材料由福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院中心實驗室提供。

表1 Sigma公司設計合成的SIRT1 siRNATab.1 SIRT1 siRNA designed and synthesized by Sigma

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：復蘇細胞后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置入飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，待細胞貼壁生長融合度達到80%后，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 siRNA篩選：均勻地接種并培養(yǎng)細胞 （5×104/孔） ，次日待細胞融合度約40%時分別用濃度為25、50、100 nmol/L的NCsiRNA、SIRT1_66siR-NA（ SASI_Hs01_00153666） 、SIRT1_67siRNA（SASI_Hs01_00153667） 、SIRT1_68siRNA（ SASI_Hs01_00153668） 進行轉染，轉染24 h后棄培養(yǎng)基并收集細胞，用于PCR及Western blotting檢測并驗證siRNA干擾效率。

1.2.3 qRT-PCR：Trizol溶液充分裂解收集的細胞，提取細胞總RNA，檢測其純度及完整性。內參片段18srRNA-112 bp；目的片段SIRT1-205 bp。SIRT1的上游引物序列為5’- AAGATGACGTCTTATCCTCT-3’，下游引物序列為5’- GCTTCATTAATTGCCTCTTG-3’，18srRNA的上游引物序列為5’- CCTGGATACCGCAG CTAGGA-3’，下游引物序列為5’- GCGGCGCAATAC GAATGCCCC-3’。反應體系總體積20 μL，其中cDNA（ 1∶20稀釋） 5.0 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、2×SYBR Green qPCR SuperMix 10 μL、dH2O 4.0 μL。反應條件為50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40個循環(huán)。分析融解曲線，計算結果。

1.2.4 Western blotting：提取細胞總蛋白，用BCA法測量蛋白質濃度；取待測蛋白樣品行SDS-PAGE電泳至溴酚藍剛出膠底部止；冰水浴中電轉移至PVDF膜上，TBST洗膜；5%脫脂奶粉溶液4 ℃封閉過夜；TBST洗膜，加入SIRT1一抗 （1∶1 000稀釋） ，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜，加入相應的二抗 （1 ∶10 000稀釋） ， 37 ℃孵育1 h，洗膜后均勻涂抹熒光發(fā)光底物，曝光顯影。

1.2.5 細胞爬片：裁剪合適大小的爬片，消毒后備用。無菌條件下，將細胞傳代到玻片上，培養(yǎng)24 h，使細胞適當擴增，取出玻片進行固定。

1.2.6 CCK-8法檢測細胞增殖：實驗分3組，即空白（TPC-1） 組、陰性對照 （NCsiRNA） 組及實驗 （SIRT1siRNA） 組。取對數(shù)生長期細胞，調整各組細胞濃度，接種至96孔板 （1×104/孔） ；每組設置3個復孔。細胞貼壁后收集0、 1、2、3 d的細胞，加入10 μL CCK-8溶液 （1∶10） ；孵育4 h后，酶標儀測定各孔吸光度值，采集OD450nm數(shù)據(jù)。依據(jù)公式計算增殖率 （同一樣品） = （其他時間點OD值均值/0時OD值均值-1）×100%。

1.2.7 β-半乳糖苷酶染色法檢測細胞衰老：向6孔板中培養(yǎng)的細胞加入染色固定液 （1 mL/孔） ，固定15 min后棄染色固定液，加入染色工作液 （1 mL/孔） ，37℃孵育過夜。普通光學顯微鏡下觀察。

1.2.8 Hoechst染色法檢測細胞凋亡：向6孔板中的細胞加入Hoechst 33258染色液 （1 mL/孔） ，充分覆蓋并在適宜溫度下培養(yǎng)20～30 min，棄染色液，用PBS洗滌2～3次后進行熒光檢測。

1.2.9 流式檢測細胞凋亡及細胞周期： （1） 細胞凋亡檢測。將含5×105個細胞的培養(yǎng)液移至干凈的離心管內，加入1.25 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min后1 000g離心5 min，棄上清，加入0.5 mL預冷的1×結合緩沖液輕輕重懸，加入10 μL溴化丙啶染色液，置于冰上避光保存。立即用流式細胞儀檢測分析。 （2） 細胞周期檢測。轉染48 h后取1×106細胞加入預冷的70%乙醇，4 ℃固定過夜，離心收集細胞，加入50 μg/mL碘化丙啶，100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4 ℃避光孵育30 min后用流式細胞儀檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗均重復3次，數(shù)據(jù)采用±s表示，2組數(shù)據(jù)的比較采用Student’st檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染TPC-1的SIRT1siRNA篩選及轉染效果的驗證

通過qRT-PCR檢測對比不同序列、不同濃度的SIRT1siRNA對TPC-1細胞轉染后SIRT1mRNA表達水平的影響結果，最終選擇序列SASI_Hs01_00153667進行后續(xù)實驗，濃度為100 nmol/L。同時，Western blotting結果證實，轉染該序列、該濃度SIRT1siRNA組 （實驗組） 的細胞較TPC-1組 （空白組） 及NCsiRNA組 （陰性對照組） 的細胞中SIRT1蛋白均呈低表達（P＜ 0.05） ，見圖1～2。

2.2 轉染SIRT1siRNA的TPC-1細胞增殖變化

CCK-8法檢測結果如圖3所示，與TPC-1組及NCsiRNA組相比，SIRT1siRNA組的細胞增殖能力減弱，24、48、72 hSIRT1siRNA組細胞增殖率下降，細胞增殖受到抑制 （均P＜ 0.05） 。

2.3 轉染組TPC-1細胞的細胞衰老變化

β-半乳糖苷酶染色結果如圖4所示，SIRT1siRNA組衰老細胞比例 （54.6%±2.7%） 較TPC-1組細胞衰老比例 （26.4%±2.2%） 及NCsiRNA組細胞衰老比例 （29.8%±3.4%） 明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05） 。提示轉染SIRT1siRNA可誘導TPC-1細胞衰老。

圖1 qRT-PCR檢測SIRT1在經過不同干擾轉染處理后的表達水平Fig.1 Relative expression of SIRT1 determined by qRT-PCR after siRNA interference

圖2 Western blotting檢測SIRT1蛋白的表達Fig.2 SIRT1 protein expression detected by Western blotting

2.4 轉染組TPC-1細胞的凋亡變化

Hoechst染色結果如圖5所示，TPC-1組凋亡細胞比例為0.03±0.01 （圖5A） ，NCsiRNA組凋亡細胞比例為0.03±0.02 （圖5B） ，SIRT1siRNA組凋亡細胞比例為0.09±0.01 （圖5C） ，SIRT1siRNA組凋亡細胞比例明顯高于TPC-1組及NCsiRNA組 （P＜ 0.05，圖5D） 。

圖3 CCK-8法檢測細胞增殖Fig.3 Cell proliferation determined by the CCK-8 method

2.5 流式細胞儀檢測轉染組TPC細胞凋亡及周期變化

流式細胞技術檢測結果顯示，SIRT1siRNA處理組的總凋亡細胞比例 （65.22%±0.41%，圖6C）較TPC-1組 （5.84%±0.16%，圖6A） 及NCsiRNA組（5.53%±0.05%，圖6B） 明顯升高 （P＜ 0.05，圖6D） 。細胞周期變化檢測結果顯示，SIRT1siRNA處理組的G1期細胞比例 （67.99%±0.87%，圖7C） 較TPC-1組（64.39%±0.77%， 圖7A） 及 NCsiRNA 組 （64.08%±0.53%，圖7B） 明顯升高 （P＜ 0.05，圖7D） ，提示SIRT1siRNA處理組TPC細胞出現(xiàn)了G1期阻滯。

3 討論

圖4 β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老Fig.4 Cell aging detected via β-galactosidase staining

圖5 Hoechst染色法檢測細胞凋亡Fig.5 Cell apoptosis detected via Hoechst staining

SIR2是一種首先在酵母中被發(fā)現(xiàn)的依賴NAD+組蛋白/非組蛋白去乙酰化酶。Sirtuins家族是一類與SIR2同源蛋白質的總稱，哺乳動物的Sirtuins家族包含了SIRT1～SIRT7的7個成員，其中SIRT1與SIR2的同源性最高［7］，亦是研究較為深入的1個成員。

圖6 流式細胞技術檢測細胞凋亡Fig.6 Cell apoptosis detected using flow cytometry

SIRT1基因位于人類第10號染色體長臂上（10q22.1） ，包含8個內含子和9個外顯子，全長約33 000 bp，編碼747個氨基酸。SIRT1蛋白位于細胞核內，其相對分子質量約為120 000［7］。SIRT1蛋白中心含有大、小2個主要的結構域，NAD+分子與這2個結構域表面結合形成酶復合體，同時，底物通過NAD+分子的協(xié)同作用在這2個結構域的裂隙中結合并發(fā)生催化反應［8］。SIRT1對諸多底物有強大的去乙酰化作用，它在正常的胚胎發(fā)育、分化及維持自身平衡中扮演著多元化的角色，是一系列生命活動不可或缺的［9］。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1通過與不同的組蛋白和非組蛋白（ 如H3［10］、p53［11-12］、p21［13］、FOXOs［14-16］、Ku70［17-18］、p300［19-20］、PGC-1α［21-22］、NF-κB［23-24］） 相互作用，在腫瘤發(fā)生、基因沉默、DNA損傷修復、延長壽命、調控細胞分化與凋亡、調節(jié)細胞周期、調節(jié)糖脂能量代謝等［25］方面發(fā)揮不同的重要功能。通過這些不同功能的相互作用，使SIRT1在作用于不同系統(tǒng)、組織、器官、細胞中產生多元化的結果。研究［26-28］表明，在乳腺癌、肺癌、結腸癌中，SIRT1表達水平顯著升高，它不但能加快細胞增殖，而且能抑制細胞衰老、凋亡，還可以促進細胞遷移，有腫瘤促進因子的作用。但SIMIC等［29］和SUN等［30］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌及肺癌細胞中SIRT1亦能負向調節(jié)癌組織上皮細胞間質轉型，從而促進癌細胞的衰老、凋亡，抑制癌細胞擴散、轉移，故認為SIRT1在乳腺癌、肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著腫瘤抑制因子的作用，而非腫瘤促進因子的作用。

本研究通過沉默體外培養(yǎng)人TPC細胞株TPC-1中SIRT1基因的表達，發(fā)現(xiàn)該細胞中SIRT1的表達水平與細胞增殖、衰老、凋亡及周期有關。本研究發(fā)現(xiàn)，在轉染了SIRT1siRNA的TPC-1細胞中，SIRT1mRNA及蛋白的表達減少，細胞增殖明顯受限，衰老細胞比例增多，凋亡細胞比例明顯升高，細胞周期停滯于G1期，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜ 0.05） 。

圖7 流式細胞技術檢測細胞周期結果Fig.7 Cell cycle analyzed using flow cytometry

綜上所述，本研究揭示了SIRT1基因沉默對人TPC細胞株TPC-1生物學功能的影響，發(fā)現(xiàn)轉染SIRT1siRNA可降低TPC-1細胞SIRT1表達水平，使細胞周期停滯，抑制細胞增殖，并誘導癌細胞衰老及凋亡。

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