焦奧，李曉航，石悅，呂武，孫寧，張城碩，李峰，張佳林

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科暨器官移植科，沈陽(yáng) 110001）

肝臟組織工程是在體外構(gòu)建仿生的肝組織，用于肝臟的替代治療，但肝臟組織體積龐大、代謝異?；钴S，沒(méi)有血管輸送氧氣和養(yǎng)料就會(huì)迅速衰竭［1］，所以肝臟組織工程血管化是亟待解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)細(xì)胞電融合法構(gòu)建了一株由肝細(xì)胞系與胰島內(nèi)皮細(xì)胞融合而成的雜交細(xì)胞系BRL-ies。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示，融合細(xì)胞體積、細(xì)胞內(nèi)顆粒密度均顯著增加，胞內(nèi)DNA含量加倍。實(shí)時(shí)定量PCR及Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，BRL-ies既表達(dá)肝組織特異性蛋白GS，又表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原CD31。BRL-ies細(xì)胞的構(gòu)建方法可為解決肝臟組織工程種子細(xì)胞血管化問(wèn)題提供一個(gè)新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自本溪長(zhǎng)生生物公司。

1.1.2 細(xì)胞系：大鼠肝細(xì)胞BRL-3A購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 設(shè)備：細(xì)胞融合儀 （寧波新芝電融合儀CRY-3B） 。

1.1.4 試劑：RPMI 1640、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于南京凱基公司；FBS胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；甲磺酸乙酯 （ethyl methanesulfonate，EMS） 、8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，8-AG） 、HAT培養(yǎng)基添加劑、HT培養(yǎng)基添加劑、膠原酶Ⅴ型購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；D-Hanks、CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司。實(shí)時(shí)PCR相關(guān)試劑購(gòu)于日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠肝細(xì)胞BRL-3A用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 BRL-3A細(xì)胞HGPRT缺陷型的構(gòu)建及篩選：按照文獻(xiàn)［2］的方法，將BRL-3A細(xì)胞按2×105/孔鋪入6孔板中。12 h后更換含500 μg/mL EMS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)基誘變24 h。之后在顯微鏡下觀察，見(jiàn)半數(shù)漂浮死亡，PBS洗3次，更換普通培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)72 h。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%，更換含20 μg/mL 8-AG的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。HGPRT缺陷型的BRL-3A細(xì)胞可在含8-AG的培養(yǎng)基中克隆增殖。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞HAT敏感性：細(xì)胞按5×103/孔鋪入96孔板中，24 h后更換HAT培養(yǎng)基，此后每24 h使用CCK-8試劑盒檢測(cè)對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取各孔吸光度，繪制增殖曲線。

1.2.4 胰島內(nèi)皮細(xì)胞的準(zhǔn)備及培養(yǎng)：按照文獻(xiàn)［3］的方法通過(guò)膽總管灌注法獲取SD大鼠胰島。通過(guò)密度梯度離心及反復(fù)手檢法獲取純凈胰島。將胰島至于15 mL離心管中離心沉降，棄上清，加入3 mL含0.05%胰蛋白酶及0.02% EDTA的消化液，后將離心管置于小型水浴鍋中保持37℃，用一次性吸管對(duì)胰島反復(fù)吹打10 min，獲得單細(xì)胞懸液。隨后立即加入1 mL FBS、10 mL D-Hanks溶液終止消化，離心后將胰島單細(xì)胞懸浮于含10% FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24～48 h后移除懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞中有較多數(shù)量的胰島內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.5 細(xì)胞電融合方案及融合細(xì)胞的篩選：將待融合細(xì)胞消化為單細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)胰島內(nèi)皮細(xì)胞與BRL-3A H2細(xì)胞，按1∶1比例將2種細(xì)胞混合后離心，使用電融合液 （0.3 mmol/L 葡萄糖，使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，濾器過(guò)濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆茫?洗滌混合細(xì)胞2次，離心后用適量電融合液重懸使細(xì)胞密度達(dá)到2×106/mL。電極（ 間距2 mm） 使用75%乙醇浸泡30 min消毒，消毒后使用無(wú)菌蒸餾水洗滌，超凈臺(tái)內(nèi)晾干備用。用移液器吸取80 μL細(xì)胞懸液于融合槽電極間，給予48 V、2 000 kHz成串脈沖持續(xù)60 s。隨后立即停止成串脈沖，激活融合脈沖使細(xì)胞融合，融合脈沖的電壓為400 V、幅度為20 μs。融合后的細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，離心去上清，加入含20% FBS的完全培養(yǎng)基，吹打均勻后撲鋪入96孔板中。24 h后更換HAT培養(yǎng)基篩選48 h，隨后更換HT培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀鑒定融合細(xì)胞：將BRL-3A H2與BRL-ies細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，分別計(jì)數(shù)2×105細(xì)胞于1.5 mL離心管中，離心后用PBS洗滌。再次離心沉淀細(xì)胞，加入1 mL預(yù)冷70%乙醇，輕輕吹打混勻，4℃過(guò)夜。之后1 000g離心3～5 min，沉淀細(xì)胞。加入約1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞。再次離心沉淀細(xì)胞，每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光水浴30 min。隨后冰浴備用，等待上機(jī)。

1.2.7 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)：將待測(cè)細(xì)胞按1×106/mL鋪入6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24～48 h后，使用Trizol法提取細(xì)胞mRNA。反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃靜置；擴(kuò)增條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s，PCR 反應(yīng) 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。各引物由生工生物工程（ 上海） 股份有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列如下。GAPDH，上游引物5’-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3’，下游 引 物 5’-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3’；GS，上游引物5’-GTACTCTGGACTGTGACCCCA-3’，下游引物5’-TGGCTGCTCACCATGTCCATT-3’；CD31，上游引物5’-GAGGTGACAGAAGGTGGGATTG-3’，下游引物5’-TGGCAGCGAAACACTAACAGG-3’。

1.2.8 Western blotting：將細(xì)胞（1×106）鋪入6 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24～48 h，后用RIPA裂解液（ 包含PMSF）提取胞內(nèi)蛋白，使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，用裂解液配平各樣品蛋白濃度，加入上樣緩沖液，蛋白煮沸變性，-20 ℃保存。配置10% SDS-PAGE凝膠，取上述蛋白制品每孔上樣20 μL，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后加一抗室溫孵育1 h后4 ℃過(guò)夜，一抗體濃度分別為GS （ abcam ab49873） 1∶1 000；CD31 （ abcam ab28364） 1∶1 000；β-Actin （ proteintech） 1∶1 000，第2天復(fù)溫2 h后加二抗室溫孵育1 h，最后加ECL發(fā)光液顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及圖表制作，采用±s描述計(jì)量資料，組間差異比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRL-3A HGPRT缺陷型細(xì)胞具有較強(qiáng)的HAT敏感性

經(jīng)過(guò)EMS誘變及8-AG篩選，得到了抗8-AG的BRL-3A細(xì)胞株，通過(guò)單克隆共得到了3株BRL-3A HGPRT缺陷性細(xì)胞，分別命名為BRL-3A H1、BRL-3A H2、BRL-3A H3。CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BRL-3A H2對(duì)HAT最為敏感，可在HAT作用48 h內(nèi)徹底死亡，見(jiàn)圖1。優(yōu)選BRL-3A H2細(xì)胞株進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)。

2.2 融合細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

圖1 CCK-8檢測(cè)HGPRT缺陷型細(xì)胞HAT敏感性Fig.1 HAT sensitivity testing by CCK-8

經(jīng)過(guò)電融合及HAT篩選，得到了多種融合細(xì)胞，其中BRL-ies胞體巨大被首先發(fā)現(xiàn)，并通過(guò)克隆環(huán)克隆出來(lái)。其中BRL-3A H2細(xì)胞呈多角形（圖2A～C），BRL-ies細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形（圖2D～F）。形態(tài)學(xué)發(fā)生較顯著變化。

2.3 融合細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析

圖2 BRL-3A H2細(xì)胞與BRL-ies細(xì)胞的光鏡照片F(xiàn)ig.2 Representative bright-field microscopy images of BRL-3A H2 and BRL-ies cells

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，融合細(xì)胞BRL-ies的體積及胞內(nèi)顆粒密度均與融合前的BRL-3A H2細(xì)胞存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜ 0.001） ，見(jiàn)圖3。其中，BRL-ies細(xì)胞的平均體積 （FSC值） 增大為BRL-3A H2細(xì)胞的1.55倍，胞內(nèi)顆粒密度 （SSC值） 增大為BRL-3A H2細(xì)胞的1.91倍。除此之外，BRL-ies細(xì)胞胞內(nèi)DNA含量加倍，見(jiàn)圖4A，證明BRL-ies是一株較為穩(wěn)定的融合細(xì)胞。根據(jù)流式細(xì)胞儀結(jié)果分析，BRL-ies為四倍體細(xì)胞，其中四倍體狀態(tài)占66.1%，八倍體占16.6%。BRL-3A H2細(xì)胞中二倍體狀態(tài)占47%，四倍體32.8%，見(jiàn)圖4B、4C。

2.4 BRL-ies細(xì)胞特異性基因表達(dá)情況

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，BRL-ies既表達(dá)GS又表達(dá)CD31，并且GSmRNA的表達(dá)水平顯著高于融合前BRL-3A H2細(xì)胞 （P＜ 0.001） ，見(jiàn)圖5。Western blotting結(jié)果顯示與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果基本一致，見(jiàn)圖6。BRL-ies細(xì)胞同時(shí)表達(dá)GS與CD31。但GS蛋白表達(dá)量與BRL-3A 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞體積及胞內(nèi)顆粒秘密度Fig.3 Volume and intracellular granule density of the hybrid cells detected by flow cytometry

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA含量Fig.4 DNA content of the hybrid cells detected by flow cytometry

圖5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CD31和GS相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Real-time PCR analysis of CD31 and GS expression

圖6 Western blotting檢測(cè)CD31和GS的表達(dá)情況Fig.6 Western blotting analysis of CD31 and GS expression

我國(guó)是肝病大國(guó)，肝功能衰竭是各種肝病患者死亡的主要原因［4］。目前，原位肝移植是治療肝功能衰竭最有效的方法，但供肝短缺嚴(yán)重限制了肝移植手術(shù)的廣泛開(kāi)展［5］。為解決這一問(wèn)題，醫(yī)學(xué)科學(xué)工作者研發(fā)了多種肝移植替代療法，其中包括肝/干細(xì)胞移植，生物人工肝及肝臟組織工程等。肝/干細(xì)胞移植操作簡(jiǎn)單、對(duì)受體影響小，但大量研究表明肝/干細(xì)胞移植療效不確切，僅能部分緩解肝功能衰竭；生物人工肝一方面具有肝臟的解毒功能，另一方面又可以通過(guò)反應(yīng)器中的肝細(xì)胞達(dá)到肝臟的合成、代謝、分泌等功能，近10年來(lái)得到了巨大發(fā)展，但由于其為暫時(shí)代替肝臟功能，只能被用于肝移植前的等待期，不能從根本上解決供肝短缺這一問(wèn)題；肝臟組織工程是利用生物學(xué)和工程學(xué)的基本原理在體外構(gòu)建類肝臟組織器官，是解決供肝不足最有前景的方法之一，然而體外培養(yǎng)的人工肝組織用于臨床前必須解決血管化這一難題。

為了使體外培育的組織塊更易于在體內(nèi)血管化，絕大多數(shù)學(xué)者采用種子細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)或疊加的方式構(gòu)建肝組織［6-8］。主要利用了內(nèi)皮細(xì)胞可加速血管生成、抗凝、抗炎等諸多特性［9-10］。

本課題組通過(guò)細(xì)胞電融合技術(shù)及HAT篩選策略，構(gòu)建了一株由大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A與原代大鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞融合而成的可穩(wěn)定傳代的四倍體細(xì)胞。這株細(xì)胞即具有內(nèi)皮細(xì)胞表型，表達(dá)CD31，又具有肝細(xì)胞特性，表達(dá)較高水平的谷氨酰胺合成酶。但此細(xì)胞株是否具備促進(jìn)血管化及肝細(xì)胞解毒功能有待未來(lái)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一株既具有內(nèi)皮細(xì)胞表型又具有肝細(xì)胞特征的融合細(xì)胞。這株細(xì)胞或許可為肝臟組織工程提供一種新的種子細(xì)胞，為肝臟組織工程的血管化問(wèn)題提供了新的解決思路。

參考文獻(xiàn)：

［1］ ZHANG L，GUAN Z，YE JS，et al. Research progress in liver tissue engineering ［J］. Biomed Mater Eng，2017，28 （S1） ：S113-S119. DOI：10.3233/BME-171632.

［2］ 賀武，宋今丹. HGPRT缺陷性人結(jié)腸癌細(xì)胞株的建立 ［J］. 細(xì)胞生物學(xué)雜志，1998 （2） ：79-82，99.

［3］ 李曉航，張佳林，李樂(lè)，等. 1種新型功能性雜交胰島β細(xì)胞系的建立 ［J］. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013 （2） ：143-148.

［4］ BERNAL W，HYYRYLAINEN A，GERA A，et al. Lessons from look-back in acute liver failure? A single centre experience of 3300 patients ［J］. J Hepatol，2013，59 （1） ：74-80. DOI：10.1016/j.jhep.2013.02.010.

［5］ WANG FS，F(xiàn)AN JG，ZHANG Z，et al. The global burden of liver disease：the major impact of China ［J］. Hepatology，2014，60 （6） ：2099-2108. DOI：10.1002/hep.27406.

［6］ KHOJASTEH A，F(xiàn)AHIMIPOUR F，JAFARIAN M，et al. Bone engineering in dog mandible：coculturing mesenchymal stem cells with endothelial progenitor cells in a composite scaffold containing vascular endothelial growth factor ［J］. J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2016，105 （7） ：1767-1777. DOI：10.1002/jbm.b.33707.

［7］ DU C，NARAYANAN K，LEONG MF，et al. Induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes and endothelial cells in multi-component hydrogel fibers for liver tissue engineering ［J］. Biomaterials，2014，35（23） ：6006-6014. DOI：10.1016/j.biomaterials.2014.04.011.

［8］ LESMAN A，KOFFLER J，ATLAS R，et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs ［J］. Biomaterials，2011，32 （31） ：7856-7869. DOI：10.1016/j.biomaterials.2011.07.003.

［9］ MICHIELS C. Endothelial cell functions ［J］. J Cell Physiol，2003，196（3） ：430-443. DOI：10.1002/jcp.10333.

［10］ PERRY L，F(xiàn)LUGELMAN MY，LEVENBERG S. Elderly patient-derived endothelial cells for vascularization of engineered muscle ［J］.Mol Ther，2017，25 （4） ：935-948. DOI：10.1016/j.ymthe.2017.02.011.