黃綿慶 ，陶桂蘭，田樹紅，韓麗芳，楊照新，符 健

（1.海南醫(yī)學院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院，海南 ?？?571199）

秋茄（Kandelia Candel）生長在熱帶和亞熱帶的陸海交匯處，屬于紅樹科秋茄樹屬植物，其特殊的生長環(huán)境受到國內(nèi)外許多學者的關注。以往的研究結果表明，秋茄枝乙醇提取物（EEKCT）具有減輕實驗2型糖尿?。═2DM）大鼠胰腺損傷的作用[1]。王芳[2]等的研究結果顯示，用鏈脲佐菌素誘導大鼠發(fā)生T2DM的機制之一就是該藥所致的氧化損傷作用可破壞大鼠的胰腺細胞。在本次研究中，筆者以通過喂養(yǎng)高脂飼料聯(lián)合注射小劑量鏈脲佐菌素制作的T2DM大鼠為研究對象，探討EEKCT在減輕T2DM大鼠胰腺損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1　主要試劑和儀器

1.1.1主要試劑 1）鏈脲佐菌素（由美國Sigma公司生產(chǎn)）、羧甲基纖維素鈉（由天津市福晨化學試劑廠生產(chǎn)）；2）檸檬酸、檸檬酸三鈉（均由廣東汕頭市西隴化工廠生產(chǎn)）；3）總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，SOD）、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛的檢測試劑盒（均由南京建成生物工程研究所研制）。

1.1.2主要儀器 UV1900PC型紫外可見分光光度計（由上海亞研電子有限公司生產(chǎn)）、Infinite F50型酶標儀（由瑞士帝肯公司生產(chǎn)）、 HY-2121A型旋渦混勻器（由南京暢翔儀器設備有限公司生產(chǎn)）、TG16-WS型臺式高速離心機（由長沙湘儀離心機儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.2　受試物

選取采自海南省文昌市東寨港的秋茄枝，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院鮑時翔教授對其進行鑒定。將秋茄枝曬干后加工成小段，并進行粉碎，然后用濃度為95%的乙醇對其進行提取，將其提取液凍干后，得到秋茄枝乙醇提取物（EEKCT）。在使用EEKC前，用濃度為1%的羧甲基纖維素鈉將其配制成濃度不等的EEKCT混懸液。

1.3　實驗用大鼠的飼料

1）大鼠的普通飼料由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務部提供，其生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2009－0013。飼料的主要成分包括：碳水化合物（占46.5%）、粗蛋白（占24.3%）和粗脂肪（占7.5%）。2）大鼠的高脂飼料由普通飼料（占73.9%）、豬油（占10%）、蛋黃粉（占10%）、白糖（占5%）、膽固醇（占1%）及豬膽鹽（占0.1%），加上適量的水充分混合后，經(jīng)75℃高溫烘干制成。

1.4　T2DM大鼠的誘導和給藥方法

1.4.1T2DM大鼠的誘導方法 選用由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供的72只SPF級SD大鼠，該公司的生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2013-0004。選用的72只大鼠均為6周齡的雄性大鼠，其體重均在170～200 g之間。在購回這72只大鼠后，先使用普通飼料對其進行1周的適應性飼養(yǎng)，然后隨機抽出12只大鼠，將其設為陰性對照組，繼續(xù)用普通飼料對該組的大鼠進行喂養(yǎng)。對其余的60只SD大鼠按筆者在先前的研究中使用的方法進行T2DM誘導[3]，即先用高脂飼料進行4周的喂養(yǎng)，然后按30 mg/kg的劑量向其腹腔內(nèi)注射濃度為0.3%的鏈脲佐菌素溶液（將鏈脲佐菌素溶于0.1 mmol/L的檸檬酸緩沖液中，制備成pH值為4.4的注射液）。在用藥1周后，檢測這60只大鼠空腹血糖的水平。T2DM大鼠模型制備成功的標準為：其空腹血糖的水平≥ 7.0 mmol/L。

1.4.2T2DM大鼠的分組和給藥方法 將制備好的60只T2DM大鼠按照體重分成5組（每組有12只大鼠），分別為模型組、維生素C組、低濃度EEKCT組、中濃度EEKCT組和高濃度EEKCT組。在分組完成后，用濃度為0.25 g/kg的EEKCT按10ml/kg的劑量為低濃度EEKCT組的大鼠進行灌胃，用濃度為1 g/kg的EEKCT為中濃度EEKCT組的大鼠進行灌胃，用濃度為2 g/kg的EEKCT為高濃度EEKCT組的大鼠進行灌胃，每天灌1次，連續(xù)用藥4周。同時，用含有濃度為0.15 g/kg維生素C的飼料對維生素C組的大鼠進行灌胃，用濃度為1%、與EEKCT等體積的羧甲基纖維素鈉溶液為陰性對照組和模型組的大鼠進行灌胃。

1.5　相關指標的檢測方法

在末次給藥后的第2 d處死6組大鼠，取出其胰腺組織，用0℃的生理鹽水對其胰腺組織進行漂洗后，用濾紙吸干胰腺組織表面的水分，并進行稱重，計算其胰腺系數(shù)（胰腺系數(shù)=胰腺重量/體重×100%）。從每只大鼠的胰腺組織中取0.2 g的樣本，將該樣本制成10%的組織勻漿，以3000 rpm的轉速對組織勻漿進行離心處理后，取上清液，然后按照試劑盒的說明書對上清標本進行T-AOC、SOD、過氧化氫酶、GSH-Px和丙二醛的檢測。

1.6　統(tǒng)計學方法

選用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對本次研究中的數(shù)據(jù)進行處理，正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，各組間的均數(shù)比較采用單因素方差進行分析，組間的兩兩比較采用SNK-q進行檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1　EEKCT對T2DM大鼠胰腺系數(shù)的影響

與陰性對照組的大鼠相比，模型組大鼠的胰腺系數(shù)明顯下降，P＜0.05。與模型組的大鼠相比，低濃度EEKCT組、中濃度EEKCT組及高濃度EEKCT組大鼠的胰腺系數(shù)均明顯升高，P＜0.05。詳見表1。

表1　EEKCT對T2DM大鼠胰腺系數(shù)的影響 （ ±s ）

表1　EEKCT對T2DM大鼠胰腺系數(shù)的影響 （ ±s ）

注：與陰性對照組的大鼠相比，**P＜0.01；與模型組的大鼠相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別（n=12）　藥物濃度（g/kg）　胰腺系數(shù)（%）陰性對照組　-　0.169±0.018模型組　-　0.115±0.024**維生素C組　0.15　0.133±0.031低濃度EEKCT組　0.25　0.138±0.019#中濃度EEKCT組　1　0.143±0.025##高濃度EEKCT組　2　0.151±0.021##

2.2　EEKCT對T2DM大鼠胰腺組織中T-AOC水平的影響

與陰性對照組的大鼠相比，模型組大鼠胰腺T-AOC的水平明顯下降，P＜0.05。與模型組的大鼠相比，中濃度EEKCT組及高濃度EEKCT組大鼠胰腺T-AOC的水平均明顯升高（均高于維生素C組大鼠），P＜0.05。詳見表2。

表2　EEKCT對T2DM大鼠胰腺組織中T-AOC水平的影響（±s ）

表2　EEKCT對T2DM大鼠胰腺組織中T-AOC水平的影響（±s ）

注：與陰性對照組的大鼠相比，**P＜0.01；與模型組的大鼠相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別（n=12）　藥物濃度（g/kg）　T-AOC（U/mgprot）陰性對照組　-　7.52±1.33模型組　-　3.93±0.92**維生素C組　0.15　5.68±2.45#低濃度EEKCT組　0.25　4.43±1.28中濃度EEKCT組　1　5.75±1.76#高濃度EEKCT組　2　6.14±2.17##

2.3　EEKCT對T2DM大鼠胰腺組織中SOD、過氧化氫酶和GSH-Px水平的影響

模型組大鼠胰腺組織中SOD、過氧化氫酶及GSH-Px的水平均明顯低于陰性對照組大鼠，P＜0.05。與模型組的大鼠相比，中濃度EEKCT組及高濃度EEKCT組大鼠胰腺組織中SOD和過氧化氫酶的水平均較高，P＜0.05。與模型組的大鼠相比，低濃度EEKCT組、中濃度EEKCT組及高濃度EEKCT組大鼠胰腺組織中GSH-Px的水平均較高，P＜0.05。詳見表3。

表3　EEKCT對T2DM大鼠胰腺組織中SOD、過氧化氫酶和GSH-Px水平的影響 （ ±s ）

注：與陰性對照組的大鼠相比，**P＜0.01；與模型組的大鼠相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別（n=12）　藥物濃度（g/kg）SOD（U/gprot）過氧化氫酶（U/gprot）GSH-Px（U/gprot）陰性對照組　-　241.5±36.4　696.2±178.6　867.3±215.4模型組　-　178.5±31.8**　348.4±162.5**　365.5±188.3**維生素C組　0.15　201.9±29.1　485.7±134.7　634.7±156.9##低濃度EEKCT組　0.25　192.4±41.6　446.3±189.4　533.6±173.7#中濃度EEKCT組　1　210.3±35.8#　503.9±207.3#　629.8±226.4##高濃度EEKCT組　2　224.7±44.5##　524.8±198.1#　687.5±203.5##

2.4　EEKCT對T2DM大鼠胰腺組織中丙二醛水平的影響

與陰性對照組的大鼠相比，模型組大鼠胰腺組織中丙二醛的水平較高，低濃度EEKCT組、中濃度EEKCT組及高濃度EEKCT組大鼠胰腺組織中丙二醛的水平均較低（尤其是中濃度EEKCT組及高濃度EEKCT組大鼠其丙二醇的水平較低），P＜0.05。詳見表4。

表4　EEKCT對T2DM大鼠胰腺組織中丙二醛水平的影響（±s ）

表4　EEKCT對T2DM大鼠胰腺組織中丙二醛水平的影響（±s ）

注：與陰性對照組的大鼠相比，**P＜0.01；與模型組的大鼠相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別（n=12）　藥物濃度（g/kg）　丙二醛（nmol/gprot）陰性對照組　-　0.53±0.21模型組　-　1.27±0.36**維生素C組　0.15　0.88±0.29##低濃度EEKCT組　0.25　1.03±0.31#中濃度EEKCT組　1　0.84±0.25##高濃度EEKCT組　2　0.72±0.23##

3　討論

海洋紅樹植物秋茄中含有甾體、萜類、鞣質(zhì)類、黃酮類及生物堿等多種化合物[4]。這些化合物具有多種多樣的生物活性，其中，萜類、鞣質(zhì)類和生物堿類化合物可能具有抗氧化活性。筆者以往的研究結果證實，秋茄枝乙醇提取物（EEKCT）具有降低T2DM大鼠血糖水平的作用[3]。筆者推測，EEKCT可能是通過自身的抗氧化活性來達到抗糖尿病的目的?，F(xiàn)代醫(yī)學研究的結果證實，人類T2DM的發(fā)病機制與人體內(nèi)發(fā)生氧化應激反應具有密切的關聯(lián)性[5-6]。在本次研究中，筆者使用小劑量的鏈脲佐菌素誘導大鼠發(fā)生T2DM也是基于同樣的機制。本次研究的結果顯示，EEKCT可增加T2DM大鼠胰腺組織中T-AOC和抗氧化酶（包括SOD、過氧化氫酶和GSH-Px）的活性，降低其胰腺組織中的脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛的水平。這說明，EEKCT具有良好的抗氧化活性。在用藥4 W后，低濃度EEKCT組、中濃度EEKCT組及高濃度EEKCT組大鼠的胰腺系數(shù)均明顯升高，P＜0.05。這一研究結果也與筆者以往的研究結果相一致[1]。

綜上所述，EEKCT的抗氧化活性可保護受損的胰腺組織，從而發(fā)揮抗T2DM的作用。在今后的臨床研究中，研究人員應對EEKCT的化學成分進行進一步的分析和結構確證，以發(fā)現(xiàn)更多抗氧化和降血糖的活性物質(zhì)，進一步地開發(fā)EEKCT的藥用價值。

[1]黃綿慶,楊照新,王小蒙,等.秋茄枝乙醇提取物減輕鏈脲佐菌素誘導的大鼠肝臟和胰腺病理損傷[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2012,12(11)：2061-2064.

[2]王芳,朱大菊,孫明謹,等.鏈脲菌素在糖尿病鼠模型中的應用及其作用機理[J].湖北醫(yī)藥學院學報,2004,23(1)：15-17.

[3]黃綿慶,王小蒙,王世雄,等．秋茄枝乙醇提取物改善2型糖尿病大鼠血糖和血脂異常[J]．中國海洋藥物,2011,30(2)：49-52.

[4]陳鐵寓,龍盛京.秋茄的化學成分和藥理作用研究概況[J].西北藥學雜志 ,2006,(3)：137-138.

[5]Tatsch E, Carvalho J A, Hausen B S, et al. Oxidative DNA damage is associated with inflammatory response, insulin resistance and microvascular complications in type 2 diabetes[J]. Muta tion Research/fundamental & Molecular Mechanisms of Mutagen esis, 2015,782(12)：17-22.

[6]Banerjee M, Vats P. Reactive metabolites and antioxidant gene polymorphisms in Type 2 diabetes mellitus[J].Redox Biology,2014,2(1)：170-177.