任曉鋒，徐保國，齊文慧，梁秋芳，張熙，馬海樂，劉堯剛，王志榮

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.金太陽糧油股份有限公司，江蘇南通226403）

油菜籽經(jīng)壓榨或者浸出所得到的油稱為毛油，通常不能直接食用，需要經(jīng)過一系列的油脂精煉工序（脫膠、脫酸、脫色和脫臭，簡稱“四脫”），使毛油的各項指標達到國家標準后，才能供人們食用[1]。其中，脫膠是油脂精煉的第一個工序，其主要目的是脫除菜籽毛油中的磷脂，若磷脂沒有脫除到合適的范圍內(nèi)，對油脂后續(xù)脫酸、脫色和脫臭的精煉過程造成非常不利的影響，不僅導致精煉的時間延長和難度加大，而且嚴重降低精煉油的品質(zhì)。酶法脫膠是將磷脂酶用于油脂脫膠的過程中，不僅脫膠效果好，而且脫膠過程中性油損失少，油脂得率高，是一種綠色環(huán)保、適用范圍廣且能為企業(yè)創(chuàng)造高經(jīng)濟效益的脫膠方法。然而，酶法脫膠的反應時間較長，酶消耗量大，增加了酶法脫膠的生產(chǎn)成本，限制了該方法在油脂脫膠工業(yè)中的應用[2-3]。

磷脂酶催化水解磷脂的反應一般是在油水界面處進行的，酶催化效率受到油水界面面積的影響；此外，酶反應效率還取決于傳質(zhì)效率和酶分子的構象[4]。超聲波作為一種機械波，廣泛應用于食品加工中的各個單元操作中，較低強度的超聲處理可導致酶分子能量的增加和介質(zhì)溫度的升高，引起酶分子構象的微小變化，使酶分子的超微結(jié)構更合理，從而表現(xiàn)出較高的催化活性。此外，超聲波空化效應產(chǎn)生的空化氣泡，在不互溶的兩相邊界破裂時，增加了酶催化反應的界面面積；并且空化氣泡破裂形成的微射流對溶液產(chǎn)生了很強的攪拌和剪切作用，也增加了酶的傳質(zhì)效率[5-6]。因此，從理論上分析，超聲波作用不僅可以提高酶法脫膠的效率，縮短脫膠的時間，而且可以提高脫膠的效果。然而，截至目前，關于多頻超聲波處理技術在酶法脫膠過程中的應用尚未報道。因此，本研究在優(yōu)化菜籽油酶法脫膠的基礎上，將多頻超聲波與菜籽油酶法脫膠相結(jié)合，研究超聲處理對菜籽油酶法脫膠的作用效果，以期為多頻超聲酶法脫膠的工業(yè)化應用提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料

磷脂酶A1（酶活10 KLU/g)：杰能科（中國）酶制劑有限公司；菜籽油毛油：江蘇金太陽糧油股份有限公司，未經(jīng)過水化預脫膠，初始含磷量為（467.32±4.79）mg/kg；檸檬酸、氫氧化鉀、鹽酸、氧化鋅、硫酸鈉、鉬酸鈉、硫酸聯(lián)氨、磷酸二氫鉀等試劑均為分析純：國藥集團上?；瘜W試劑公司。

1.2　儀器及設備

多模式超聲波發(fā)生裝置：江蘇大學研制；WFJ 7200型可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；PHS-3C精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；LD5-2A離心機：北京醫(yī)用離心機廠；1010-3B型電熱鼓風干燥箱：上海實驗儀器廠有限公司；SHZ-88A往復式水浴恒溫振蕩器：太倉市實驗設備廠；SX2-4-10-S馬弗爐：上海帥登儀器有限公司。

1.3　試驗方法

1.3.1　酶法脫除菜籽油中磷脂的方法及工藝優(yōu)化

準確稱取菜籽毛油100 g于250 mL的具塞錐形瓶中，放進恒溫水浴鍋中加熱到80℃；滴加0.13 mL質(zhì)量濃度為40%的檸檬酸溶液；然后在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min的均質(zhì)機內(nèi)均質(zhì)1 min，均質(zhì)結(jié)束后在80℃的溫度下攪拌30 min，攪拌的轉(zhuǎn)速為500 r/min；加入4 mol/L的NaOH溶液和一定量的去離子水混合均勻。調(diào)節(jié)pH值并滴加一定量的水，再攪拌后加入磷脂酶A1在一定的酶解條件下進行酶解，最后將酶解后的菜籽油升溫至90℃，滅酶10 min；在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上層油層；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到脫膠菜籽油，測定其中磷脂的含量。按照上述步驟優(yōu)化酶解時間、磷脂酶用量、菜籽油含水量、反應pH值和反應溫度等酶法脫除菜籽油中磷脂的工藝。

1.3.2　多模式超聲波輔助酶法脫除菜籽油中磷脂的方法

準確稱取菜籽毛油100 g于250 mL的具塞錐形瓶中，放進恒溫水浴鍋中加熱到80℃；滴加0.13 mL質(zhì)量濃度為40%的檸檬酸溶液；然后在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min的均質(zhì)機內(nèi)均質(zhì)1 min，均質(zhì)結(jié)束后在80℃的溫度下攪拌30 min，攪拌的轉(zhuǎn)速為500 r/min；加入4 mol/L的NaOH溶液和一定量的去離子水混合均勻。調(diào)節(jié)pH值并滴加一定量的水，再攪拌后加入磷脂酶A1，在最優(yōu)的酶解條件下進行酶解同時進行超聲處理。超聲的條件：20、50、20/50、20/35/50 kHz的不同超聲頻率組合，超聲功率為50 W～300 W，超聲波脈沖工作方式為工作10 s、間隔3 s；在超聲波反應器內(nèi)攪拌（500 r/min）酶解反應一定時間，將酶解后的菜籽油升溫至90℃，滅酶10 min；在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上層油層；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到脫膠菜籽油，測定其中磷脂的含量。

1.3.3　菜籽油中磷脂含量的測定

按照GB/T 5537-2008《糧油檢驗磷脂含量的測定》測定。

2　結(jié)果與分析

2.1　磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的工藝優(yōu)化

2.1.1　酶解時間對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響

酶解時間對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響如圖1所示。

圖1　酶解時間對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響Fig.1　Effect of reaction time on phospholipase removal from rapeseed oil by phospholipase

從圖1可以看出，酶解反應30 min后，菜籽油中的含磷量迅速下降。與對照相比（不加磷脂酶），酶法處理的菜籽油中磷脂含量降低速度明顯比常規(guī)條件下的速度要快，加入磷脂酶A1酶解反應30 min后的菜籽油含磷量降低到35mg/kg左右，而不加入磷脂酶A1的菜籽油含磷量降低到60mg/kg左右。隨著反應的繼續(xù)進行，當反應到3 h以后，菜籽油的磷脂脫除的速率趨于平緩，繼續(xù)增加反應時間菜籽油的含磷量變化不大，這與毛程鑫等的研究結(jié)果一致[7]。綜合考慮將酶脫除磷脂的反應的時間定為3 h，這樣既能夠讓酶解反應順利進行，也可以提高后續(xù)試驗中磷脂酶的脫除磷脂效率。

2.1.2　酶用量對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響

磷脂酶A1添加量對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響如圖2所示。

圖2　酶用量對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響Fig.2　Effect of enzyme dosage on phospholipase removal from rapeseed oil by phospholipase

從圖2可以看出，磷脂酶A1的用量變化對菜籽油脫磷脂有很大影響。菜籽油含磷量隨著酶用量的增加而降低，當酶用量在15 μL/kg時，菜籽油的含磷量為55mg/kg，與菜籽油毛油的含磷量相比，脫膠油的含磷量降低了90%。當酶用量在90 μL/kg時，菜籽油脫膠油的含磷量為22mg/kg；繼續(xù)增大酶的用量，磷含量雖然有所降低，但整體變化不大；當酶用量為120 μL/kg時，菜籽油含磷量降低到21mg/kg?？紤]到生產(chǎn)成本，最適酶添加量，可選90 μL/kg。

2.1.3　菜籽油毛油含水量對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響

菜籽油毛油含水量對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響如圖3所示。

圖3　含水量對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響Fig.3　Effect of water content on phospholipid in rapeseed oil by phospholipase

酶解后菜籽油含磷量隨含水量的增加而降低。這說明含水量對磷脂酶脫除菜籽油中的磷脂起到了一定的作用，因為磷脂酶是水油界面酶，因此必須要有水的存在，磷脂酶才會發(fā)揮作用。與對照組相比，加入磷脂酶的脫膠效果優(yōu)于不加入磷脂酶的脫膠效果，這說明磷脂酶在該反應中降低菜籽油脫膠油中磷脂的主要因素之一。從圖3可以看出，隨著含水量的增加，兩組試驗的含磷量都得到了降低，加入磷脂酶的菜籽油毛油在1%的含水量時的含磷量為37mg/kg；在2%的含水量時的含磷量為20.7mg/kg，達到了最低。由圖中可以看出，當含水量為5%時，可能造成磷脂的乳化，反而會增加后期試驗中分離的難度[8]。出于對磷脂酶A1的脫膠效果的考慮，較適菜籽油毛油的含水量為2%。

2.1.4　pH值對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響

菜籽油毛油pH值對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響如圖4所示。

圖4　pH值對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響Fig.4　Effect of pH on phospholipid removal from rapeseed oil by phospholipase

反應體系pH值變化，會引起菜籽油脫膠油含磷量的顯著變化。磷脂酶A1是酸性酶，反應體系的pH值會影響磷脂酶A1的反應活性[9]。從圖4中可以看出，隨著pH值的增加，菜籽油脫膠油的含磷量先降低后上升。在pH值為4.8時降到最低，此時菜籽油脫膠油的含磷量為18mg/kg；在pH值上升到5.4時，菜籽油脫膠油的含磷量為38mg/kg。通過試驗結(jié)果可以看出，磷脂酶A1脫除菜籽油中磷脂的較適pH值為4.8，此時菜籽油中磷脂的脫除效果最好，較適反應pH值為4.8。

2.1.5　反應溫度對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響

反應溫度對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響如圖5所示。

圖5　反應溫度對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響Fig.5　Effect of reaction temperature on phospholipase removal from rapeseed oil by phospholipase

對照組的含磷量受反應溫度變化的影響不大，含磷量在55 m/kg的數(shù)值上下波動。反應溫度對磷脂酶脫除菜籽油的試驗有影響，溫度是影響酶活性的主要因素之一[7]，隨著反應溫度的升高，含磷量呈現(xiàn)先降低后升高的現(xiàn)象。結(jié)合酶的反應特性可以得出，當溫度從20℃不斷升高到40℃時，菜籽油的含磷量不斷降低，從30mg/kg降到最低16mg/kg；溫度不斷升高，菜籽油的含磷量又不斷上升，到60℃時，菜籽油的含磷量為45mg/kg，再升高溫度，酶容易失活，脫膠效果也較差。溫度過低或者過高都會影響酶的活性，因此較適反應溫度選擇40℃。

2.2　多模式超聲波輔助磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的工藝優(yōu)化

2.2.1　超聲頻率對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響

分別在 20、50、20/50、20/35/50 kHz的不同超聲頻率組合下對菜籽油進行超聲輔助脫膠處理，多模式組合超聲波頻率對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響如圖6所示。

圖6　超聲頻率對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響Fig.6　Effect of ultrasonic frequency on phospholipase removal from rapeseed oil by phospholipase

由圖6可見超聲頻率對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響較大，不同超聲頻率及組合作用下菜籽油脫膠油的含磷量也不同。當超聲頻率為20 kHz時，菜籽油脫膠油的含磷量為23mg/kg；當超聲頻率為50 kHz時，菜籽油脫膠油的含磷量為19mg/kg；當超聲頻率為20/50 kHz時，菜籽油脫膠油的含磷量為15mg/kg；當超聲頻率為20/35/50 kHz時，菜籽油脫膠油的含磷量為17mg/kg。超聲頻率為20/50 kHz時菜籽油毛油的磷含量最低，菜籽油的脫膠效果也最好，因此最適超聲波頻率組合為20/50 kHz。馮若等研究表明對反應體系作用以頻率為fa的超聲波時，只有體系的共振頻率fr接近于fa時，體系的超聲化學產(chǎn)額才能達到最大[10]。超聲頻率為20/50 kHz雙頻頻率組合可能更加接近磷脂酶催化菜籽油反應體系的共振頻率，所以菜籽油的脫膠效果最好。

2.2.2　超聲功率對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響

超聲功率對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響如圖7所示。

圖7　超聲功率對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響Fig.7　Effect of ultrasonic power on phospholipase removal from rapeseed oil

超聲波的功率強度對酶活性有較重要的影響，適當強度的超聲波可以使酶活力達到最佳狀態(tài)。相反，不適當強度的超聲波處理不但不會增強酶活力，甚至可以降低酶的活力[11]。由圖7可見在不同超聲功率的作用下，磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的試驗效果明顯，當超聲功率為60 W時，菜籽油脫膠油的含磷量為14.2mg/kg；超聲功率為120 W時，菜籽油脫膠油的含磷量為16.4mg/kg；超聲功率為180 W時，菜籽油脫膠油的含磷量為10.13mg/kg；超聲功率為240 W時，菜籽油脫膠油的含磷量為20.6mg/kg；超聲功率為300 W時，菜籽油脫膠油的含磷量為16.5mg/kg。相比較得知，在超聲功率為180 W時，超聲輔助磷脂酶脫膠效果最為顯著，接近標準規(guī)定的10mg/kg，因此，較適超聲功率為180 W。朱少娟[12]等發(fā)現(xiàn)超聲波影響酶及底物分子構象，適宜的超聲波改變了酶與底物的熒光吸收光譜和熒光強度，可能使酶的活性中心更暴露，底物結(jié)構更松散，促進酶與底物的結(jié)合，適宜的超聲波提高了胰蛋白酶的探討水解效率。

2.2.3　超聲時間對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響

超聲時間對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響如圖8所示。

圖8　超聲時間對磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的影響Fig.8　Effect of ultrasonic time on phospholipid removal from rapeseed oil by phospholipase

由圖8可見隨著超聲時間的增加菜籽油的含磷量也不斷的下降。在超聲開始的10 min內(nèi)含磷量下降迅速，達到13.65mg/kg，對照組即僅采用磷脂酶A1處理的含磷量也下降到42.48mg/kg，超聲處理能將菜籽油的含磷量明顯降低。當超聲時間超過30 min后，菜籽油的含磷量降到10mg/kg以下；超聲60 min時菜籽油的含磷量下降到4.36mg/kg，與菜籽油毛油相比較，含磷量降低了99%，60 min以后基本穩(wěn)定。根據(jù)對照組即僅采用磷脂酶A1處理，可以看出，雖然不超聲處理只經(jīng)過加酶處理也可以使菜籽油的含磷量降低，含磷量在37mg/kg上下波動，但是不能達到國家規(guī)定標準10mg/kg以下的要求，試驗反應需要更長的時間。超聲處理不僅可以降低菜籽油毛油的磷含量，而且還可以有效的縮短反應時間，大大的降低了工廠操作的時間，節(jié)約了反應成本以及人力[13]。因此較適超聲處理時間為60 min。

3　結(jié)論

1）單因素優(yōu)化磷脂酶脫除菜籽油中磷脂的工藝為：磷脂酶A1用量為90 μL/kg毛油，pH值為4.8，酶解反應溫度為40℃，含水量為2%，酶解時間3 h；在此條件下，菜籽油的含磷量為16mg/kg。

2）適宜的超聲波處理可顯著提高磷脂酶A1對菜籽油的磷脂脫除率；超聲波對磷脂酶A1的作用效果與超聲功率、超聲時間和超聲頻率密切相關；經(jīng)過超聲功率為180 W，超聲頻率為20/50 kHz，超聲時間為60 min的多模式超聲波輔助磷脂酶解，菜籽油磷脂含量降低至4.36mg/kg。

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