成煥，王傳花，2，李珂，2，郭亦晨，趙志友，王遠(yuǎn)亮，2，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南省檳榔加工與食用安全工程技術(shù)研究中心，湖南湘潭411201；4.湖南省檳榔產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟理事長(zhǎng)單位，湖南湘潭411201）

檳榔為棕櫚科植物檳榔（Areca catechu L.）的成熟種子。原生長(zhǎng)在馬來(lái)西亞的熱帶雨林中，目前主要分布在印度和東南亞各國(guó)[1]。外形呈扁球形或圓錐形，表面淡黃棕色或淡紅棕色，質(zhì)地堅(jiān)硬，斷面可見大理石樣花紋。檳榔含生物堿、鞣質(zhì)、脂肪油及檳榔紅色素、氨基酸等成分，具有殺蟲，消積，行氣，利水，截瘧的功效[2]。檳榔作為世界四大嗜好品之一，大部分以果殼加工制品進(jìn)行銷售[3]，果核部分多作為廢品處理。近來(lái)研究表明[4-5]，檳榔果核中含有大量多酚，值得進(jìn)行理化研究和深加工處理。目前已從檳榔中檢測(cè)出的酚類物質(zhì)主要有兒茶素、單寧酸、表沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素等9種物質(zhì)[6-8]，這些化合物具有良好的抗氧化活性[9-10]，在治療炎癥[11-12]、心血管疾病[13]、癌癥[14]等方面具有藥用潛力。

近年來(lái)，隨著人們對(duì)食品安全性的重視，天然產(chǎn)物的開發(fā)利用得到了極大發(fā)展，植物多酚以其分布的廣泛性、生理功能的多樣性以及來(lái)源豐富性等特點(diǎn)[15]，成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。將這些生物活性多酚與檳榔中的有害成分分離，既可促進(jìn)對(duì)檳榔的安全使用又有益環(huán)境。該試驗(yàn)以檳榔鮮果為原料，采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法，以提取劑濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比為試驗(yàn)因素，以提取液中的多酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合及其優(yōu)化分析，有效的提高多酚得率，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

檳榔鮮果：2017年1月購(gòu)于海南省定安縣，果核干燥、粉碎備用。

無(wú)水乙醇：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；甲醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙酮：衡陽(yáng)市凱信化工試劑股份有限公司；無(wú)水碳酸鈉：上海虹光化工廠；Folin酚試劑：合肥博美生物；沒(méi)食子酸一水物（純度≥98.5%）：上海瑞永生物科技有限公司。

1.2　儀器與設(shè)備

ANJIEFD-1A-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；WGL-125B電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；TD5A臺(tái)式多管架離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限責(zé)任公司；WFJ7200型可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；CP411電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3　方法

1.3.1　沒(méi)食子酸工作曲線的繪制

以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，參考GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[16]，根據(jù)FC-酚法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱?。?.110±0.001）g沒(méi)食子酸（相對(duì)分子質(zhì)量188.14），制成100 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取1.0 mL～7.0 mL到100 mL容量瓶并定容，再各移取1.0 mL與5.0 mL 10%的Folin酚試劑和4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液于室溫暗反應(yīng)1 h，在765 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)吸光值。以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，溶液吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.011 X+0.017 7（R2=0.999）。

1.3.2　檳榔干物質(zhì)測(cè)定

取檳榔鮮果，分別采用熱風(fēng)干燥和冷凍干燥后充分粉碎，收集果核粉末，用恒重法[17]進(jìn)行測(cè)定。

干物質(zhì)質(zhì)量按下式計(jì)算：

式中：m0為試樣原始質(zhì)量，g；m1為干燥后試樣質(zhì)量，g。

1.3.3　檳榔核多酚的提取及其含量測(cè)定[16]

準(zhǔn)確稱取果核粉末0.2 g，加入10 mL提取劑，采用水浴加熱法進(jìn)行提取，冷卻后于3 500 r/min離心10 min，收集上清液，加提取劑定容至10 mL為母液，取母液1.0 mL用水定容至100 mL為測(cè)試液。取測(cè)試液1.0 mL，采用和標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測(cè)定樣品中總多酚的含量，以沒(méi)食子酸計(jì)。

多酚得率按下式計(jì)算：

式中：A為樣品測(cè)試液吸光值；V為樣品提取液體積，mL；d為稀釋因子（通常為1 mL稀釋成100 mL，稀釋因子為100）；SLOPstd為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；m為樣品干物質(zhì)質(zhì)量，%；m1為樣品質(zhì)量，g。

多酚含量按下式計(jì)算：

式中：C為溶液中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；d為稀釋因子（通常為1 mL稀釋成100 mL，稀釋因子為100）；V為樣品提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4　單因素試驗(yàn)[18-19]

按1.3.3中操作方法對(duì)檳榔核中的多酚進(jìn)行提取和測(cè)定，固定其他條件不變，分別考察干燥方式（熱風(fēng)干燥60℃處理24 h、冷凍干燥-53℃處理24 h）；提取劑（水、70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮）；提取劑體積分?jǐn)?shù)（30%～70%）；提取溫度（40℃～80℃）；提取時(shí)間（10 min～90 min）；料液比 1 ∶20（g/mL）～1 ∶60（g/mL）；提取次數(shù)（1次～5次）對(duì)多酚提取率的影響，以提取液中的多酚含量為考察指標(biāo)。

1.3.5　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[20]

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，選取對(duì)多酚提取率影響較大的4個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，以多酚含量為響應(yīng)值，確定檳榔核多酚最適宜提取條件，并進(jìn)行驗(yàn)證，響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平及編碼見表1。

表1　響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1　Factors and their coded levels used in experimental design for response surface methodology

1.4　統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)單因素試驗(yàn)平行處理3次，采用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)、顯著性分析、制作圖表，結(jié)果用x±s表示；響應(yīng)面結(jié)果用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化及方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　檳榔核干物質(zhì)質(zhì)量

按1.3.2方法操作，測(cè)得烘干和凍干的檳榔核干物質(zhì)質(zhì)量分別為92.96%和89.89%。

2.2　單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1　不同干燥方式與提取劑對(duì)檳榔核多酚得率的影響

不同干燥方式與提取劑對(duì)檳榔核多酚得率的影響見圖1。

圖1　不同干燥方式與提取劑對(duì)多酚得率的影響Fig.1　Effect of different drying methods and extractants on the extraction efficiency of polyphenols

有圖1可以看出，長(zhǎng)時(shí)間的熱風(fēng)干燥會(huì)使多酚大量損失。C Ratti在試驗(yàn)中指出，熱風(fēng)干燥會(huì)引起材料皺縮，成分損壞，而冷凍干燥的過(guò)程中樣品的結(jié)構(gòu)不會(huì)被破壞，可有效保留產(chǎn)品的生物和化學(xué)結(jié)構(gòu)及其活性的完整性[21-22]。在試驗(yàn)的4種提取劑中，冷凍干燥的提取效果均優(yōu)于相同條件下的熱風(fēng)干燥，熱風(fēng)干燥處理的樣品多酚提取率約是凍干處理的73%左右。

多酚物質(zhì)極性較強(qiáng)，易溶于水和有機(jī)溶劑。本試驗(yàn)采用使用最多的4種溶劑進(jìn)行考察，根據(jù)相似相溶原理，發(fā)現(xiàn)丙酮的提取效果最好。Chavan Y等[23]對(duì)比了乙酸乙酯等8種提取劑，也證明丙酮對(duì)檳榔核多酚的提取更為有效。Paula Kuma[24]則在西芹多酚的提取試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)丙酮水溶液僅對(duì)多酚總量的提取最好，對(duì)于單一成分來(lái)說(shuō)并不一定是最合適的。這可能是由于丙酮與檳榔核多酚中的大多數(shù)成分極性更為相似，極性相似的溶劑可以使提取物充分溶于溶劑中從而被提取出來(lái)。同時(shí)以丙酮作為提取劑，對(duì)提取物的抗自由基能力可起到一定積極作用[25]。

2.2.2　丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)檳榔核多酚得率的影響

丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)檳榔核多酚得率的影響見圖2。

圖2　丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響Fig.2　Effect of acetone concentration on the extraction efficiency of polyphenols

從圖2可以看出，多酚提取率隨丙酮體積分?jǐn)?shù)的增大先緩慢增加后快速減小，在50%時(shí)達(dá)到最大值，為39.53%。多酚在植物體內(nèi)常與蛋白質(zhì)等以氫鍵的形式形成穩(wěn)定的復(fù)合物，丙酮體積分?jǐn)?shù)過(guò)低，溶劑對(duì)氫鍵的破壞能力不強(qiáng)，從而使提取率降低；丙酮體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，溶劑極性低，導(dǎo)致提取率下降，并且會(huì)增加色素等脂溶性物質(zhì)的溶出[26-27]，給后續(xù)的分離純化工作造成不便。因此，選擇50%的丙酮作為較佳提取劑濃度。

2.2.3　提取時(shí)間對(duì)檳榔核多酚得率的影響

提取時(shí)間對(duì)檳榔核多酚得率的影響見圖3。

圖3　提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.3　Effect of time on the extraction efficiency of polyphenols

從圖3可以看出，在90 min內(nèi)，多酚提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減小，提取時(shí)間為50 min時(shí)多酚含量最大為41.04%。當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，提取液中的多酚含量緩慢下降，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的高溫條件使多酚的分解速率大于了溶出速率。徐瑋等[28]通過(guò)正交試驗(yàn)證明加熱時(shí)間控制在60 min以內(nèi)，加熱溫度100℃～140℃，茶多酚的損失率可控制在15%以內(nèi)。

2.2.4　提取溫度對(duì)檳榔核多酚得率的影響

提取溫度對(duì)檳榔核多酚得率的影響見圖4。

圖4　提取溫度對(duì)多酚得率的影響Fig.4　Effect of temperature on the extraction efficiency of polyphenols

從圖4可以看出，在40℃～80℃范圍內(nèi)，多酚含量隨著溫度的升高而迅速升高，在70℃達(dá)到最大值，含量為40.96%。溫度進(jìn)一步升高，高溫促使多酚類物質(zhì)的氧化變性，因此，多酚含量有著明顯的下降，80℃多酚提取率同70℃多酚提取率有著顯著性差異（P＜0.05），因此，70℃是最佳提取溫度。Sólyom K 等[29]以葡萄渣和過(guò)濾液為例測(cè)試了不同溫度和加熱時(shí)間下的多酚分解狀況，相同條件下提取物的不同形態(tài)也會(huì)影響多酚的分解程度。

2.2.5　料液比對(duì)檳榔核多酚得率的影響

料液比對(duì)檳榔核多酚得率的影響見圖5。

由圖5可以看出，隨著液料比的增大，提取液中的多酚含量逐漸升高，在1∶40（g/mL）時(shí)達(dá)到最大，再提高料液比時(shí)多酚得率反而下降，液料比改變，提取液中的多酚含量的差異顯著（P＜0.05）。提高溶劑比例不但會(huì)增大不必要的溶劑成本，還會(huì)給后續(xù)濃縮提純帶來(lái)不便，因此選擇料液比為1∶40（g/mL）。

圖5　料液比對(duì)多酚得率的影響Fig.5　Effect of solid/liquid ratio on the extraction efficiency of polyphenols

2.2.6　提取次數(shù)對(duì)檳榔核多酚得率的影響

提取次數(shù)對(duì)檳榔核多酚得率的影響見圖6。

圖6　提取次數(shù)對(duì)多酚得率的影響Fig.6　Effect of number of extractions on the extraction efficiency of polyphenols

多次提取可以增加提取液中的多酚含量，但會(huì)對(duì)后續(xù)的分離純化造成一定難度。由圖6可知，1次就能將檳榔核中的大部分多酚提出，重復(fù)一次還能獲得少量多酚。第3次、4次提取液中多酚含量少，且差異不顯著（P＜0.05）。本試驗(yàn)中選擇提取一次，實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)實(shí)際條件選擇1次～2次提取。

2.3　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1　Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，表中1～24號(hào)為析因點(diǎn)，25號(hào)～29號(hào)為零點(diǎn)，重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。以提取液中的多酚含量為響應(yīng)值。

2.3.2　方差分析

回歸模型方差分析見表3。

運(yùn)用Design-Expert軟件，對(duì)檳榔果核多酚提取率顯著影響因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到檳榔果核多酚提取率（Y）的多元二次回歸模型：

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Box-Behnken experimental design matrix and results

表3　回歸模型方差分析Table 3　ANOVA for response surface quadratic model

由表3可知，該回歸方程模型的P＜0.000 1，模型極顯著，而失擬項(xiàng)不顯著P=0.369 3＞0.05，試驗(yàn)誤差??；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.939 1，校正決定系數(shù)R2adj=0.878 2，表明該方程具有較好的模擬性，可用于優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析，以確定丙酮提取檳榔核多酚的最優(yōu)工藝條件。各因素對(duì)響應(yīng)值影響大小順序?yàn)椋毫弦罕龋咎崛囟龋颈w積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。

一次項(xiàng)C、D均達(dá)到了極顯著的水平（P＜0.01），而A、B不顯著（P＞0.05），說(shuō)明提取溫度和料液比對(duì)響應(yīng)值影響較大，故要得良好的響應(yīng)值，需要嚴(yán)格控制提取溫度和料液比。除AD之間的交互作用極顯著外，其余因素之間的交互因素并不顯著，其P值遠(yuǎn)大于0.05，表明交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響較小。方差分析結(jié)果還顯示，C、D的二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)目標(biāo)值均有極顯著影響。

2.3.3　響應(yīng)面分析

各因素交互作用對(duì)檳榔核多酚得率的影響見圖7。

圖7　各因素交互作用對(duì)檳榔核多酚得率的影響Fig.7　Interactive effects of various factors on the extraction efficiency of polyphenols

由圖7可知，開始時(shí)提取液中的多酚含量隨丙酮體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度水平的增大而增大，達(dá)到各因素中心值以后，得率隨各因素增大而逐漸減小。對(duì)比各圖可知，料液比和提取溫度對(duì)響應(yīng)值的影響大，表現(xiàn)為圖7f的曲面較陡，由此可見，控制好料液比和提取溫度對(duì)取得良好的提取效果至關(guān)重要。而丙酮濃度和提取時(shí)間響應(yīng)面相對(duì)較為平緩，說(shuō)明該因素對(duì)得率影響較小。由圖7c可知，丙酮體積分?jǐn)?shù)與料液比的交互因素較強(qiáng)外，其余各因素間的交互作用不強(qiáng)，表現(xiàn)為等高線為橢圓形，其余各圖的等高線橢圓形狀不明顯，這與回歸方程的方差分析結(jié)果一致，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)可以較好地反映出丙酮體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素對(duì)檳榔核多酚提取情況的影響。

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件分析計(jì)算可得到最佳提取工藝條件：丙酮體積分?jǐn)?shù)50.49%、浸提溫度68.35℃、提取時(shí)間 47.69 min、料液比 1∶38.06（g/mL），在此條件下，回歸模型預(yù)測(cè)的多酚含量的理論值可達(dá)40.61%。

2.4　工藝條件的優(yōu)化和驗(yàn)證

由Design-Expert 8.0軟件得出的多酚的最佳提取條件為：丙酮體積分?jǐn)?shù)50.49%、浸提溫度68.35℃、提取時(shí)間 47.69 min、料液比 1 ∶38.06（g/mL）。此條件下模型預(yù)測(cè)的最大得率為40.61%。考慮到實(shí)際操作的局限性，將理論值修正為丙酮體積分?jǐn)?shù)50%、浸提溫度 68℃、提取時(shí)間 48 min、料液比 1∶38（g/mL）。此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，提取液的多酚得率為40.43%（即367.39mg/g，由多酚含量計(jì)算公式可得出），與理論值40.61%接近，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際得率。韓林[5]用乙醇對(duì)檳榔核進(jìn)行多酚提取，在最佳工藝參數(shù)下提取物的總酚含量為160.95mg/g。其優(yōu)化條件是以檳榔殼作為試驗(yàn)對(duì)象得到的，由于殼與核本身存在組織形態(tài)、成分含量的差別，故該條件并不一定是檳榔核的最適工藝，導(dǎo)致提取效率低于本試驗(yàn)。Chavan Y等[23]采用旋轉(zhuǎn)振蕩法用丙酮提取產(chǎn)于印度的檳榔的果核多酚，在最佳工藝參數(shù)下得率為407.47mg/g，要高于本試驗(yàn)提取效率。除了品種和產(chǎn)地原因外，也可能是由于振蕩加強(qiáng)了提取劑與檳榔粉末的接觸，更大程度的滲透進(jìn)檳榔的細(xì)胞組織，促進(jìn)了多酚的擴(kuò)散效率?？梢娦D(zhuǎn)振蕩和超聲處理對(duì)于多酚提取是一種有效的輔助手段，在后續(xù)試驗(yàn)中可以嘗試、驗(yàn)證。

3　結(jié)論與討論

本研究?jī)?yōu)化了丙酮提取檳榔核多酚的工藝參數(shù)，其中各因素對(duì)得率的影響大小順序?yàn)椋毫弦罕龋咎崛囟龋颈w積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。按實(shí)際情況優(yōu)化后的最佳工藝條件為丙酮體積分?jǐn)?shù)50%、浸提溫度68℃、提取時(shí)間 48 min、料液比 1 ∶38（g/mL），在此條件下，檳榔核多酚得率達(dá)到最大值40.43%，與理論預(yù)測(cè)值基本一致。本提取過(guò)程中未采用任何輔助方法，在與其他研究結(jié)果比較中發(fā)現(xiàn)超聲輔助的空化作用[30]和微波輔助的高能效果[31]都能在一定程度上提高效率。試驗(yàn)中可根據(jù)試驗(yàn)條件添加輔助方式。本試驗(yàn)作為基礎(chǔ)研究可為檳榔核多酚的深入研究提供數(shù)據(jù)支持。

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