彭浩，王賢，溫曉鳴，秦宏偉，王曉強，宋文路，*

（1.濟寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜273155；2.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266071）

空心蓮子草 （Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb）是多年生草本植物，屬于莧科（Amaranthaceae）蓮子草屬（Alternanthera）?？招纳徸硬菪晕陡屎疅o毒，具有涼血、清熱、解毒的功效。目前已于空心蓮子草中分離得到多糖、皂苷、蒽醌、有機酸、萜、甾醇、生物堿、內(nèi)酰胺、無機鹽和氨基酸等多種化學(xué)成分[1-6]。

多糖作為構(gòu)成生命的四大基礎(chǔ)物質(zhì)之一，廣泛存在于植物，動物及微生物中。目前植物多糖已發(fā)掘出其抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性等作用[7-9]。植物多糖的傳統(tǒng)提取方法為水提法。近年來，隨著新興提取技術(shù)的快速發(fā)展，超聲波輔助法、酶法、微波輔助法[10-12]等在植物多糖的提取中得到了應(yīng)用。由于植物多糖的復(fù)雜性和多樣性，單一的提取方法可能達不到最好的效果，故使用多種方法進行協(xié)同提取，如超聲-微波法，超聲-酶法，微波-酶法等[13-15]，利用其各自優(yōu)勢使多糖提取率得到提升。

超聲波是一種能夠產(chǎn)生并傳遞強大能量的彈性波，能使物質(zhì)中分子加速運動，有利于植物細胞中的有效成分轉(zhuǎn)移、擴散及提取[16-17]；纖維素是植物細胞壁的主要成分，亦是胞內(nèi)多糖等大分子溶出的主要屏障，利用纖維素酶水解細胞壁，更加有利于胞內(nèi)成分的溶出[18]。因此，分別采用超聲波輔助法（utrasonicassisted extraction，UAE）、酶法（enaymatic extraction，EE）、超聲-酶法協(xié)同法（ultraaonic-assisted enzymatic extraction，UAE-EE）從空心蓮子草植株中提取多糖，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，考察并比較不同提取方法對多糖提取率的影響，為空心蓮子草多糖（Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb polysaccharides，APPs）的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

空心蓮子草：5月份采集于山東省濟寧市南四湖區(qū)域，并經(jīng)濟寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系李彥連副教授鑒定為莧科蓮子草屬植物空心蓮子草（Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb）的植株。纖維素酶（25 000 U/g）：生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄糖：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇、苯酚：天津市富宇精細化工有限公司；濃硫酸：煙臺市雙雙化工有限公司（均為分析純）。

1.2　儀器與設(shè)備

DC-2000低溫恒溫槽：上海橫平儀器廠；T6新世紀紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FN2004電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器有限公司；TGL16高速冷凍離心機：長沙英泰儀器有限公司；DHG9070電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海瑯玕試驗設(shè)備有限公司；RHP-400A型高速多功能粉碎機：浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司。

1.3　方法

1.3.1　材料預(yù)處理

將新鮮的空心蓮子草加入電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，用高速粉碎機將其粉碎，過80目篩?？招纳徸硬莘勰┯阱a箔紙包裹的廣口瓶中暗處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2　APPs提取工藝流程

稱取一定量空心蓮子草干粉，按液料比加入適量的去離子水，分別采用超聲波處理或纖維素酶處理2 h并滅酶或纖維素酶處理2 h并滅酶后超聲波處理。上述處理后，溶液于4 000 r/min離心30 min，上清液中加3倍體積無水乙醇，4℃醇沉過夜。4 000 r/min離心15 min，沉淀真空干燥，得空心蓮子草粗多糖。用苯酚-硫酸光度法測多糖含量[19]，計算提取率。

1.3.3　單因素試驗

1.3.3.1　超聲波輔助法

考察液料比、超聲時間、超聲功率對APPs提取率的影響，單因素試驗設(shè)計如下：固定超聲時間30 min、超聲功率 250 W，不同液料比為 10∶1、15∶1、20∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）；固定液料比 20 ∶1（mL/g）、超聲功率 250 W，不同超聲時間為 10、20、30、40、50 min；固定液料比 20 ∶1（mL/g）、超聲時間 30 min，不同超聲功率為 150、175、200、225、250 W。

1.3.3.2　酶法

考察液料比、酶量、酶解溫度對APPs提取率的影響，單因素試驗設(shè)計如下：固定酶解溫度50℃、酶量300 U/g，不同液料比為 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）；固定液料比 20∶1（mL/g）、酶解溫度 50 ℃，不同酶量為 150、300、450、600、750 U/g；固定液料比為20 ∶1（mL/g）、酶量為 300 U/g，不同酶解溫度為 40、45、50、55、60 ℃。

1.3.3.3　超聲-酶協(xié)同法

考察液料比、酶量、超聲時間對APPs提取率的影響，單因素試驗設(shè)計如下：酶量300 U/g、超聲時間20 min，不同液料比為 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）；固定液料比 20 ∶1（mL/g）、超聲時間 20 min，不同酶用量為 150、300、450、600、750 U/g；固定液料比20 ∶1（mL/g）、酶量 300 U/g，不同超聲時間為 10、15、20、25、30 min。

1.3.4　Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析

采用中心組合試驗，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，每種提取方法分別選取3個因素為自變量，每個因素選取3個水平，以多糖提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化提取條件。利用Design-Expert8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，建立三元二次回歸模型。

2　結(jié)果與分析

2.1　響應(yīng)面試驗因素水平的確定

3種提取方法的單因素試驗結(jié)果見圖1～圖3。

圖1　超聲波輔助法提取過程中不同提取參數(shù)對粗多糖提取率的影響Fig.1　Effect of different extraction parameters on APPs yields with UAE process

圖2　酶法提取過程中不同提取參數(shù)對粗多糖提取率的影響Fig.2　Effect of different extraction parameters on APPs yields with EE process

圖3　超聲-酶協(xié)同法提取過程中不同提取參數(shù)對粗多糖提取率的影響Fig.3　Effect of different extraction parameters on APPs yields with UAE-EE process

根據(jù)圖1～圖3單因素結(jié)果設(shè)計各提取方法中心組合試驗的因素水平，見表1～表3。

表1　UAE法提取APPs工藝優(yōu)化中心組合試驗因素水平表Table 1　Factors and levels of central composite design（CCD）of UAE method for the APPs yields

表2　EE法提取APPs工藝優(yōu)化中心組合試驗因素水平表Table 2　Factors and levels of central composite design（CCD）of EE method for the APPs yields

表3　UAE-EE法提取APPs工藝優(yōu)化中心組合試驗因素水平表Table 3　Factors and levels of central composite design（CCD）of UAE-EE method for the APPs yields

2.2　響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果及方差分析

UAE法提取APPs工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，其回歸模型方差分析結(jié)果見表5。

表4　UAE法提取APPs工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4　BBD matrix with response values of UAE method for the APPs yields

續(xù)表4　UAE法提取APPs工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 4　BBD matrix with response values of UAE method for the APPs yields

表5　UAE法回歸模型方差分析Table 5　Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model of UAE method

利用Design-Expert 8.0軟件對表4試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y=5.26-0.11X1-0.050X2-0.081X3+0.14X1X2+0.28X1X3-0.070X2X3-對回歸模型進行方差分析，從表5可以看出，一次項 X1，二次項和交互項 X1X2、X1X3對多糖提取率影響極顯著（P＜0.001）。一次項X3對提取率有顯著影響（P＜0.05）。其他項對提取得率影響不顯著（P＞0.05）。從表5可以看出，優(yōu)化建立的回歸模型P＜0.000 1，說明回歸模型達到極顯著水平，方程對實際試驗有較好的擬合性；相關(guān)系數(shù)R2為0.985 9，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj為0.967 9也顯示模型擬合程度較好，試驗誤差較?。皇M項不顯著（P=0.651 1＞0.05），說明非試驗因素對結(jié)果的影響不大，可以用此模型對UAE法提取空心蓮子草多糖進行預(yù)測分析。EE法提取APPs工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表6，其回歸模型方差分析結(jié)果見表7。

表6　EE法提取APPs工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6　BBD matrix with response values of EE method for the APPs yields

表7　EE法回歸模型方差分析Table 7　Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model of EE method

利用Design-Expert 8.0軟件對表6試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y=5.5+0.011X4-0.06X5-0.089X6+0.047X4X5+0.31X4X6+0.038X5X6-對回歸模型進行方差分析，從表7可以看出，一次項 X6，二次項和交互項 X4X6對多糖提取率影響極顯著（P＜0.01）。一次項X5對提取率有顯著影響（P＜0.05）。其他項對提取得率影響不顯著（P＞0.05）。從表7還可以看出，優(yōu)化建立的回歸模型P＜0.000 1，說明回歸模型達到極顯著水平，方程對實際試驗有較好的擬合性；相關(guān)系數(shù)R2為0.990 5，修正相關(guān)系數(shù)為0.978 2也顯示模型擬合程度較好，試驗誤差較?。皇M項不顯著（P=0.473 4＞0.05），說明非試驗因素對結(jié)果的影響不大，可以用此模型對EE法提取空心蓮子草多糖進行預(yù)測分析。UAE-EE法提取APPs工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表8，其回歸模型方差分析結(jié)果見表9。

表8　UAE-EE法提取APPs工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 8　BBD matrix with response values of UAE-EE method for the APPs yields

表9　UAE-EE法回歸模型方差分析Table 9　Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model of UAE-EE method

續(xù)表9　UAE-EE法回歸模型方差分析Continue table 9　Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model of UAE-EE method

利用Design-Expert 8.0軟件對表8試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y=5.64-0.034X7+0.093X8+0.077X9+0.025X7X8-0.070X7X9-0.025X8X9-對回歸模型進行方差分析，從表9可以看出，一次項 X8、X9，二次項和交互項X7X9對多糖提取率影響極顯著（P＜0.01）。一次項X7對提取率有顯著影響（P＜0.05）。其他項對提取得率影響不顯著（P＞0.05）。從表9還可以看出，優(yōu)化建立的回歸模型P＜0.000 1，說明回歸模型達到極顯著水平，方程對實際試驗有較好的擬合性；相關(guān)系數(shù)R2為0.993 1，修正相關(guān)系數(shù)為0.984 2也顯示模型擬合程度較好，試驗誤差較小；失擬項不顯著（P=0.302 5＞0.05），說明非試驗因素對結(jié)果的影響不大，可以用此模型對UAE-EE法提取空心蓮子草多糖進行預(yù)測分析。

2.3　各試驗因素的交互作用對APPs提取率的影響

通過響應(yīng)面三維圖可直觀地反映各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，從而確定最佳工藝范圍，根據(jù)擬合模型繪制APPs提取率三維響應(yīng)面圖，見圖4～圖6。比較響應(yīng)面三維圖可知，在所選范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)面最高點。

圖4　UAE法各因素交互作用對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface plots showing the effects of various factors on the APPs yields of the UAE method

固定超聲功率175 W，如圖4a所示，提取率隨液料比升高和超聲時間延長呈先增大后減小的趨勢。在液料比 18 ∶1（mL/g）～20 ∶1（mL/g），超聲時間 32.5 min～40 min之間時，響應(yīng)值達到最大。說明在一定的范圍內(nèi)增加液料比和延長超聲時間都有利于多糖的提取。水在超聲波提取過程中起介質(zhì)作用。溶劑用量少，原料細胞組織浸潤不完全，提取效果差。溶劑量增大，超聲波介質(zhì)增多，降低了多糖物質(zhì)向外擴散的阻力，多糖提取率不斷增大[20]。但溶劑過多會消耗大量超聲波輻射能量，因而影響多糖的析出[21]。同時，延長超聲時間可使超聲波對固體組織的空化、剪切效能累積量增加，組織細胞破碎程度和多糖的溶出量增加，因此提取率明顯提高。但處理時間過長，產(chǎn)生較強的機械剪切作用，使組織中大量的細胞進一步破裂，細胞內(nèi)大量不溶物及黏性物質(zhì)等混入提取液中，增大了傳質(zhì)阻力，影響了多糖成分的溶出；同時，隨著超聲提取時間的延長，超聲波較強的空化和機械振動使部分多糖大分子鏈斷裂，其小分子糖在醇沉處理過程中損失掉，從而降低了多糖的提取率[22]。固定超聲時間40 min，如圖4b 所示，在液料比 15 ∶1（mL/g）～19 ∶1（mL/g），超聲功率150 W～165 W之間時，響應(yīng)值達到最大，此后提取率顯著降低。對于一個給定的介質(zhì)和單位體積的提取溶劑，振動與超聲功率呈正比。高的超聲功率產(chǎn)生更強的振動，導(dǎo)致更強空化和剪切效應(yīng)，多糖的傳質(zhì)效率提高，提取率增加。然而，過高超聲功率可能造成多糖解聚和黏度降低，從而導(dǎo)致提取率降低[23]。固定液料比20∶1（mL/g），如圖4c所示，隨超聲時間和超聲功率增大，多糖提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。在超聲時間37.5 min～42.5 min，超聲功率160 W～170 W之間時，響應(yīng)值達到最大。圖4各圖中響應(yīng)曲面的坡度均相對較為陡峭，表明響應(yīng)值對液料比、超聲時間和超聲功率改變較為敏感。從等高線可直觀看出，UAE法中兩兩因素之間交互作用較強，影響顯著。

圖5　EE法各因素交互作用對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface plots showing the effects of various factors on the APPs yields of the EE method

固定酶解溫度55℃，如圖5a所示，提取率隨液料比升高和酶量的增加呈先增大后減小的趨勢。在液料比 24 ∶1（mL/g）～26 ∶1（mL/g），酶量 350 U/g～450 U/g之間時，響應(yīng)值達到最大。說明在一定的范圍內(nèi)增加液料比和酶量有利于細胞壁的分解和溶質(zhì)的釋放。而酶量過多時，沒有足夠的底物與之反應(yīng)，因此多糖提取量不再變化。固定酶量450 U/g，如圖5b所示，當(dāng)液料比為 22∶1（mL/g）～25∶1（mL/g），酶解溫度達 50℃～54℃之間時，響應(yīng)值達到最大。隨著液料比和酶解溫度的進一步升高，多糖提取率逐漸降低。說明在一定的溫度范圍內(nèi)較高溫度可以有效降低提取劑的黏度和密度，利于提取溶劑向固體組織內(nèi)部的滲透和多糖由組織內(nèi)部向周圍溶劑的擴散；同時，在一定范圍內(nèi)升高溫度會增加酶的催化活性，提高酶解的效率[7]。但溫度過高會降低酶的活性，且導(dǎo)致溶劑的揮發(fā)和雜質(zhì)溶出量的增加，從而降低了多糖提取率[7，18，24]。固定液料比25∶1（mL/g），如圖5c所示，隨酶量和酶解溫度的增大，多糖提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。酶量400 U/g～500 U/g，酶解溫度51℃～54℃之間時，響應(yīng)值達到最大。圖5各圖中響應(yīng)曲面的坡度均相對較為陡峭，表明響應(yīng)值對液料比、酶量和酶解溫度改變較為敏感。從等高線可直觀看出，EE法中酶量和酶解溫度交互作用較弱，其余兩兩因素交互作用較強，影響顯著。

圖6　UAE-EE法各因素交互作用對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6　Response surface plots showing the effects of various factors on the APPs yields of the UAE-EE method

固定超聲時間25 min，如圖6a所示，提取率隨液料比升高和酶量的增加呈先增大后減小的趨勢。隨液料比 24 ∶1（mL/g）～28 ∶1（mL/g），酶量 450 U/g～525 U/g之間時，響應(yīng)值達到最大。固定酶量450 U/g，如圖6b所示，酶量450 U/g～550 U/g與超聲時間24 min～26 min之間時，響應(yīng)值達到最大。固定液料比25∶1（mL/g），如圖 6c 所示，液料比 24 ∶1（mL/g）～26 ∶1（mL/g）和超聲時間24 min～26 min之間時，響應(yīng)值達到最大。圖6各圖中響應(yīng)曲面的坡度均相對較為陡峭，表明響應(yīng)值對液料比、酶量和超聲功率改變較為敏感。從等高線可直觀看出，UAE-EE法中兩兩因素之間交互作用較強，影響顯著。

2.4　最優(yōu)工藝參數(shù)的確定及驗證試驗

通過對回歸模型求解方程，得到APPs提取工藝的最優(yōu)組合如下，UAE法：液料比為19.02∶1（mL/g），超聲時間為38.72 min，超聲功率為165.28 W，多糖提取率為5.29%。修正后的最佳工藝條件為：液料比為19∶1（mL/g），超聲時間為 39 min，超聲功率為 165 W。EE 法：液料比為 24.44∶1（mL/g），酶量 433.35 U/g，酶解溫度為53.83℃，多糖提取率為5.52%。修正后的最佳工藝條件為：液料比為 24∶1（mL/g）、酶量為 433 U/g、酶解溫度為54℃。UAE-EE法：液料比為23.83∶1（mL/g），酶量470.85 U/g，超聲時間為25.69min，多糖提取率為5.64%。修正后的最佳工藝條件為：液料比24∶1（mL/g），酶量471 U/g，超聲時間為26 min。分別進行驗證試驗，各3次重復(fù)，得到多糖提取率平均分別為（5.19±0.16）%、（5.44±0.13）%、（5.82±0.21）%。驗證試驗值與模型預(yù)測值基本一致，表明預(yù)測值和真實值之間有很好的擬合性，進一步驗證了模型的可靠性。

3　結(jié)論

以山東省濟寧市南四湖區(qū)域5月份所產(chǎn)同一批次的空心蓮子草為試驗原料，采用超聲波輔助法、酶法、超聲-酶協(xié)同法3種提取方法制備了APPs，使用響應(yīng)面法分別對其進行優(yōu)化，并對使用各優(yōu)化工藝得到的多糖提取率進行了測定和比較。分別確定了3種提取工藝的最佳條件，且最優(yōu)條件下APPs提取率大小排列依次為超聲-酶協(xié)同法＞酶法＞超聲波輔助法。因此，超聲波和纖維素酶處理均為提取APPs的有效方法，同時超聲波作用又能夠促進纖維素酶提取過程的進行，超聲-酶協(xié)同提取作為一個高效的綠色提取技術(shù)，能夠更加合理而有效的應(yīng)用于空心蓮子草多糖成分的提取，可以廣泛應(yīng)用于從植物原料中提取有效成分。然而，不同提取方法對空心蓮子草多糖結(jié)構(gòu)的影響及其與抗氧化活性之間的關(guān)系，尚待進一步研究。

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