王軍 趙思語 歐陽少波 廖嵐

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身腫瘤的第九位，且近年來呈增高趨勢［1］。因其具有早期診斷難、易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且預(yù)后差等特點(diǎn)，5年整體生存率僅為50%左右［2］。目前其診斷主要依靠臨床檢查和組織活檢，且因患者就診時(shí)往往已處于癌癥中晚期，影響療效。另外一些血漿腫瘤標(biāo)志物的檢測，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖鏈抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9），對(duì)口腔鱗癌早期診斷的敏感性和特異性尚不明確［3］。因此，尋找敏感度高和特異性強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物是近年來口腔鱗癌研究的熱點(diǎn)。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200個(gè)核苷酸、不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA［4］。近年研究表明，lncRNA的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)［5］。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA能夠穩(wěn)定存在于外周血中，其檢測對(duì)于疾病診斷及判斷預(yù)后具有重要意義［6］。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1）是最早發(fā)現(xiàn)的 lncRNA之一，與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移密切相關(guān)［7－8］。已有研究表明MALAT1在口腔鱗癌組織中異常表達(dá)，可能參與口腔鱗癌的發(fā)病過程［9－10］，然而尚未見有關(guān)其在口腔鱗癌血漿中表達(dá)的報(bào)道。本研究旨在檢測MALAT1在口腔鱗癌患者血漿中的表達(dá)水平，分析其與口腔鱗癌臨床病理特征之間的關(guān)系，并探討其在口腔鱗癌診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015-01～2017-01在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔頜面外科收治的口腔鱗癌患者70例，其中男42例，女28例，年齡37～73歲，中位年齡52歲?？谇击[癌患者均為初次確診，術(shù)前均未進(jìn)行過化療、放療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療，且無合并其他腫瘤、高血壓、糖尿病、感染性疾病及免疫系統(tǒng)疾病。鱗癌原發(fā)灶及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶均經(jīng)由組織病理確診。詳細(xì)記錄腫瘤部位、大小、TNM分期、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等參數(shù)。并采集15例患者術(shù)后30 d靜脈血用于比較手術(shù)前、后血漿MALAT1變化。選取同期南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院健康體檢者作為對(duì)照組，共50例，男性28例，女22例，年齡34～75歲，中位年齡50歲。健康對(duì)照人群無口腔黏膜疾病，且無腫瘤、高血壓、糖尿病、感染性疾病及免疫系統(tǒng)疾病。口腔鱗癌組及健康對(duì)照組之間年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究已通過南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（7500型 ABI，美國）；Trizol LS試劑（Invitrogen，美國）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和 SYBR?Premix Ex TaqTM（大連寶生物TaKaRa公司）；熒光定量PCR引物（上海生工生物工程技術(shù)有限公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 清晨分別采集口腔鱗癌組和健康對(duì)照組外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝，并盡快進(jìn)行血漿分離，即4℃1 000 g，離心10 min，吸取上清液至EP管，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血漿總RNA的提取及cDNA合成 按Trizol LS試劑說明書提取血漿樣本總RNA，DEPC處理過的蒸餾水溶解。采用分光光度儀檢測總RNA濃度和質(zhì)量。檢測合格后取1μl RNA，采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）反應(yīng) 采用SYBR法進(jìn)行RT-qPCR檢測，檢測步驟及反應(yīng)條件參照試劑盒說明書進(jìn)行。內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物為 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；MALAT1上游引物為：5′-CTTAAGCGCAGCGCCATTTT-3′，下游引物為 5′-CCTC CAAACCCCAAGACCAA-3′。以20μl反應(yīng)體系進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系為：1×SYBR Green Imaster-mix、0.5 μmol／L特異前向引物、0.5μmol／L特異反向引物、1 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 10 min后，95℃15 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s，共40循環(huán)。所有樣品做3復(fù)孔。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法對(duì)RT-qPCR結(jié)果進(jìn)行分析，以2－△△Ct表示口腔鱗癌血漿目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Kolmogorov-Smirnov（K-S）檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，手術(shù)治療前后患者血漿MALAT1表達(dá)水平比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間的比較采用ANOVA方差分析。采用GraphPad Prism 5軟件，以敏感度為縱坐標(biāo)，1-特異度為橫坐標(biāo)繪制口腔鱗癌組和健康對(duì)照組相比較的受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC），并計(jì)算曲線下面積（area under of ROC curve，AUC）評(píng)估血漿MALAT1的診斷效能。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 口腔鱗癌患者與健康對(duì)照組血漿MALAT1表達(dá)水平的比較

采用RT-qPCR技術(shù)檢測受試者血漿中MALAT1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，口腔鱗癌患者血漿中的MALAT1的相對(duì)表達(dá)量（2.12±1.18）高于健康對(duì)照組（1.02±0.44）（t＝5.84，P＜0.001）。

2.2 口腔鱗癌患者血漿MALAT1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

分析血漿MALAT1的表達(dá)與口腔鱗癌患者臨床病理特征（年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤大小、腫瘤分化程度、有無淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期等）之間的關(guān)系。結(jié)果表明，血漿MALAT1的相對(duì)表達(dá)量與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05）（表 1）。

表1 口腔鱗癌患者血漿MALAT1表達(dá)水平和臨床病理參數(shù)的相關(guān)性（±s）Tab 1 The relationship between the expression of plasma MALAT1 and its clinicopathologic features of OSCC（±s）

表1 口腔鱗癌患者血漿MALAT1表達(dá)水平和臨床病理參數(shù)的相關(guān)性（±s）Tab 1 The relationship between the expression of plasma MALAT1 and its clinicopathologic features of OSCC（±s）

臨床病理參數(shù) n 血漿MALAT1的表達(dá)量 P值性別 男45 1.99±0.18 ＝0.610女25 2.16±0.23年齡（歲） ≤50 22 1.89±0.19 ＝0.445＞50 48 2.14±0.18腫瘤類型 舌癌 33 2.28±1.29 ＝0.142牙齦癌 18 1.49±0.50頰黏膜癌 10 2.13±1.02腭癌 5 2.26±1.99唇癌 4 2.31±1.23腫瘤大小 T1 17 2.08±0.93 ＝0.558 T2 31 1.91±1.30 T3 10 1.95±0.59 T4 12 2.48±1.54 TNM分期 Ⅰ＋Ⅱ期 47 1.74±0.89 ＝0.005Ⅲ ＋Ⅳ期 23 2.69±1.46腫瘤分化程度 中、高分化 56 1.88±0.92 ＝0.016低分化 14 2.75±1.80頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無 53 1.76±0.88 ＝0.001有17 3.03±1.83

2.3 手術(shù)治療前后口腔鱗癌患者血漿MALAT1表達(dá)水平變化

對(duì)15例成功接受口腔鱗癌手術(shù)治療的患者手術(shù)前后血漿MALAT1水平進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果顯示，術(shù)后30 d血漿 MALAT1表達(dá)（1.16±0.56）與術(shù)前（2.68±1.35）相比顯著降低（P＜0.001）（圖 1）。

2.4 血漿MALAT1在口腔鱗癌患者中的診斷價(jià)值

采用ROC曲線評(píng)估血漿MALAT1作為口腔鱗癌生物標(biāo)記物的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，血漿MALAT1診斷口腔鱗癌 ROC的 AUC為 0.814（95%CI：0.738－0.891；P＜0.001），具有較好的診斷效果，以 1.18為臨界值，血漿MALAT1鑒別口腔鱗癌和健康對(duì)照的敏感度和特異度分別為87.43%和72.00%（圖2）。

3 討 論

圖1 口腔鱗癌患者手術(shù)前后血漿中MALAT1表達(dá)水平Fig 1 Relative expression levels of plasma MALAT1 between preand post-operation samples

圖2 血漿MALAT1診斷口腔鱗癌的ROC曲線Fig 2 Receiver operating characteristic（ROC）curve analysis of plasma MALAT1 for the discriminative ability of OSCC patients vs healthy controls

口腔鱗癌是口腔頜面部最常見的的惡性腫瘤之一，包括吸煙在內(nèi)的多種因素可以導(dǎo)致口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體病因尚未明確［11］。盡管現(xiàn)在包括手術(shù)、放療和化療等在內(nèi)的治療技術(shù)已經(jīng)取得長足進(jìn)步，但是由于口腔鱗癌患者早期常無明顯癥狀不易引起重視，造成確診時(shí)患者往往已處于腫瘤進(jìn)展期或晚期，導(dǎo)致患者的5年生存率幾乎沒有提高［12］。早診斷早治療能夠大大提高口腔鱗癌患者的預(yù)后生存期，但由于口腔活組織病理學(xué)檢查具有有創(chuàng)性且操作復(fù)雜，并可能造成癌細(xì)胞的擴(kuò)散，不適用于大量人群的篩查。因此，迫切需要探尋一種更加有效的腫瘤標(biāo)記物用于口腔鱗癌的早期診斷。

越來越多的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用［13］。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA廣泛存在于外周血中，如血清、血漿等，且循環(huán)lncRNA可以穩(wěn)定存在于循環(huán)系統(tǒng)中［14］。近年來，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)循環(huán)lncRNA的表達(dá)與正常人存在差異，并隨著腫瘤的發(fā)展而具有特異性變化，是腫瘤診斷潛在的生物學(xué)標(biāo)志物［15－16］。例如，Wang等［17］發(fā)現(xiàn)食管癌患者血清中HOTAIR表達(dá)顯著上調(diào)，ROC分析結(jié)果顯示HOTAIR診斷食管癌的曲線下面積為0.793。Zhou等［18］研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血漿中H19表達(dá)異常，對(duì)胃癌的診斷具有一定價(jià)值。已有研究報(bào)道了在口腔鱗癌病變組織中存在諸多異常表達(dá)的lncRNA，如HOTAIR［19］、UCA1［20］等。目前尚未見有關(guān)循環(huán) lncRNA在口腔鱗癌中的研究報(bào)道。

MALAT1最早在非小細(xì)胞肺癌的研究中被發(fā)現(xiàn)，全長6 700 bp，位于染色體11q13.1，是lncRNA家族的重要成員之一。大量研究證實(shí)MALAT1可通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、發(fā)揮競爭性內(nèi)源性信使RNA作用或參與表觀遺傳調(diào)控以及細(xì)胞周期調(diào)控［21］，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。其被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌等［22］。在口腔鱗癌研究中，Zhou等［9］發(fā)現(xiàn)在口腔鱗癌癌組織中MALAT1表達(dá)顯著上調(diào)，并且高表達(dá)的MALAT1可以通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。本研究著重探討MALAT1在口腔鱗癌患者血漿中表達(dá)水平的變化及其是否可作為口腔鱗癌診斷的可靠生物標(biāo)志物。

本研究通過RT-qPCR技術(shù)對(duì)70例口腔鱗癌患者及50例健康對(duì)照者血漿MALAT1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MALAT1在口腔鱗癌血漿中表達(dá)顯著上調(diào)，且MALAT1的相對(duì)表達(dá)量與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。15例接受口腔鱗癌手術(shù)治療的患者術(shù)后30 d血漿中MALAT1表達(dá)水平顯著降低，提示術(shù)后監(jiān)測血漿 MALAT1表達(dá)水平或有助于監(jiān)測口腔鱗癌的療效和預(yù)后。ROC曲線分析顯示血漿MALAT1診斷口腔鱗癌的ROC曲線下面積為0.814，提示其可作為診斷口腔鱗癌的的有效標(biāo)識(shí)。

需要指出的是，由于本研究收集樣本的時(shí)間較短，未對(duì)口腔鱗癌患者長期隨訪以觀察疾病進(jìn)展和生存預(yù)后情況，因此未能分析血漿中MALAT1的表達(dá)與患者生存率之間的相關(guān)性。在下一步研究中，將在擴(kuò)大樣本量的同時(shí)對(duì)口腔鱗癌患者進(jìn)行定期隨訪，以進(jìn)一步分析血漿中 MALAT1的表達(dá)值在口腔鱗癌患者預(yù)后判斷中的意義。

綜上，本研究結(jié)果表明血漿MALAT1在口腔鱗癌患者中表達(dá)顯著上調(diào)，并且其表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，有望成為口腔鱗癌早期診斷及療效監(jiān)測的潛在生物標(biāo)記物。

［1］Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016［J］.CA Cancer JClin，2016，66（1）：7－30.

［2］KeshavarziM，DarijaniM，Momeni F，et al.Molecular imaging and oral cancer diagnosis and therapy［J］.JCell Biochem，2017，118（10）：3055－3060.

［3］Rivera C，Oliveira AK，Costa RAP，et al.Prognostic biomarkers in oral squamous cell carcinoma：A systematic review［J］.Oral Oncol，2017，72：38－47.

［4］Huang Z，Luo Q，Yao F，et al.Identification of Differentially Expressed Long Non-coding RNAs in Polarized Macrophages［J］.Sci Rep，2016，6：19705.

［5］歐陽少波，張鵬，王軍，等.長鏈非編碼RNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄子2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2016，51（5）：286－291.

［6］鄧楨，蘇日古，黃自坤.循環(huán)lncRNA作為疾病診斷潛在標(biāo)志物的研究進(jìn)展［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2017，97（24）：1913－1917.

［7］Li Z，Xu C，Ding B，etal.Long non-coding RNA MALAT1 promotes proliferation and suppresses apoptosis of glioma cells through derepressing Rap1B by sponging miR-101［J］.JNeurooncol，2017，134（1）：19－28.

［8］黃自坤，姚芳苡，羅清，等.長鏈非編碼RNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1在結(jié)核感染中的表達(dá)及意義［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2016，36（11）：824－830.

［9］Zhou X，Liu S，CaiG，et al.Long non coding RNA MALAT1 promotes tumor growth and metastasis by inducing epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma［J］.Sci Rep，2015，5：15972.

［10］Liang J，Liang L，Ouyang K，et al.MALAT1 induces tongue cancer cells＇EMT and inhibits apoptosis through Wnt／β-catenin signaling pathway［J］.JOral Pathol Med，2017，46（2）：98－105.

［11］Chi AC，Day TA，Neville BW.Oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma——An update［J］.CA Cancer JClin，2015，65（5）：401－421.

［12］陳浩，馬洪，段曉峰，等.NEK2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（3）：436－438.

［13］蘇花，周珅玥，郭新程，等.LncRNA H19與OSF發(fā)生及癌變的關(guān)系［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（2）：235－238.

［14］Tang J，Jiang R，Deng L，et al.Circulation long non-coding RNAs actas biomarkers for predicting tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma［J］.Oncotarget，2015，6（6）：4505－4515.

［15］Wen JJ，Ma YD，Yang GS，et al.Analysis of circulating long non-coding RNA UCA1 as potential biomarkers for diagnosis and prognosis of osteosarcoma［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（3）：498－503.

［16］Zhang Y，Zhang K，Luo Z，et al.Circulating long non-coding HOX transcript antisense intergenic ribonucleic acid in plasma as a potential biomarker for diagnosis of breast cancer［J］.Thorac Cancer，2016，7（6）：627－632.

［17］Wang W，He X，Zheng Z，et al.Serum HOTAIR as a novel diagnostic biomarker for esophageal squamous cell carcinoma［J］.Mol Cancer，2017，16（1）：75.

［18］Zhou X，Yin C，Dang Y，et al.Identification of the long non-coding RNA H19 in plasma as a novel biomarker for diagnosis of gastric cancer［J］.Sci Rep，2015，5：11516.

［19］Liu H，Li Z，Wang C，etal.Expression of long non-coding RNA-HOTAIR in oral squamous cell carcinoma Tca8113 cells and its associated biological behavior［J］.Am JTransl Res，2016，8（11）：4726－4734.

［20］Yang YT，Wang YF，Lai JY，et al.Long non-coding RNA UCA1 contributes to the progression of oral squamous cell carcinoma by regulating theWNT／β-catenin signaling pathway［J］.Cancer Sci，2016，107（11）：1581－1589.

［21］Wang Y，Zhang Y，Yang T，et al.Long non-coding RNA MALAT1 for promoting metastasis and proliferation by acting as a ceRNA ofmiR-144-3p in osteosarcoma cells［J］.Oncotarget，2017，8（35）：59417－59434.

［22］宋鐵峰，袁穎，王會(huì)琴，等.長鏈非編碼 RNA MALAT1的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2016，32（1）：20－28.