江成英 ， 王 松 ， 李 琰 ， 徐婷婷 ， 張文學(xué) ， 韓國棟 ， 姜未公

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

目前，運用微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料越來越受到重視。飼料種曲能為菌種提供良好的生長環(huán)境，使其大量繁殖，利于發(fā)酵底物能夠更好更快的發(fā)酵。玉米黃粉是濕法生產(chǎn)玉米淀粉的下腳料，雖然其中所含蛋白質(zhì)水溶性差，直接做為飼料動物的消化利用率低，但其可做為一種生產(chǎn)發(fā)酵蛋白飼料的良好基質(zhì) （趙文揚等，2015；賈祥祥等，2011）。本研究以玉米黃粉為基質(zhì)，主要從麩皮添加量、加水量、混合菌種的接種量、制曲溫度和制曲時間五個方面進行單因素試驗，并設(shè)計正交優(yōu)化試驗，最終確定多菌種固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料種曲的制備條件。

1　材料與方法

1.1主要材料 熱帶假絲酵母、納豆芽孢桿菌、

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌由齊齊哈爾大學(xué)生物工程實驗室保藏；玉米黃粉由中糧生化能源（龍江）有限公司提供；麩皮為市售。

1.2主要試劑 葡萄糖、瓊脂、胰蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、磷酸氫二鉀等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，顯微鏡，全溫振蕩器，超凈工作臺，血球計數(shù)板等。

1.4試驗方法

1.4.1活菌總數(shù)的測定 種曲中活菌總數(shù)的測定采用平板活菌計數(shù)法（胡明等，2013）。

1.4.2單因素試驗 將所用五種菌以一定的比例（枯草芽孢桿菌∶熱帶假絲酵母菌∶嗜熱乳桿菌∶納豆芽孢桿菌∶地衣芽孢桿菌=3∶3∶1∶4∶2）混合，接種于種曲制備培養(yǎng)基中進行種曲的制備，通過測定活菌總數(shù)研究種曲的制備條件。

1.4.3正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對種曲制備的麩皮添加量、加水量、混合菌種的接種量、制曲溫度和制曲時間設(shè)計五因素四水平L16（45）的正交優(yōu)化試驗，以確定多菌種固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料種曲制備的條件。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素試驗

2.1.1麩皮添加量對制曲的影響 玉米黃粉持水性差，加水后易黏結(jié)，使制曲物料透氣性不好從而影響菌種的呼吸，通過添加麩皮可改善其疏松度。本研究以玉米黃粉為基質(zhì)，分別添加30%、40%、50%、60%、70%、80%的麩皮并加入1.2倍的水配制種曲培養(yǎng)基，接入5%的混合菌種，在30℃條件下培養(yǎng)72 h后取樣測定種曲中的活菌總數(shù)，確定麩皮添加量。結(jié)果如表1所示。

表1　不同麩皮添加量對種曲中活菌總數(shù)的影響

由表1可知，隨著麩皮添加量的不斷增加，種曲中的活菌總數(shù)也不斷增加，當麩皮添加量達到70%時，活菌總數(shù)達到最大，隨后略有降低。主要原因是由于麩皮含量的提高使種曲的疏松度變好，適宜微生物的生長，但過高的麩皮含量使培養(yǎng)基中氮源不足，而導(dǎo)致菌體繁殖量減少。 因此確定麩皮添加量為70%。

2.1.2加水量對制曲的影響 水分活度是影響微生物生長的重要因素之一，培養(yǎng)底物中的水分含量決定著微生物的生長狀態(tài)。以玉米黃粉為基質(zhì)，添加70%的麩皮配制種曲培養(yǎng)基，分別加入1、1.2、1.4、1.6、1.8 倍的水， 接入 5%的混合菌種，在30℃條件下培養(yǎng)72 h后取樣測定種曲中的活菌總數(shù)，確定加水量。結(jié)果如表2所示。

表2　不同加水量對種曲中活菌總數(shù)的影響

由圖2可知，隨著水分含量的增加種曲的微生物總數(shù)也不斷增加，當料水比為1∶1.6時微生物總數(shù)達到最大，為11.73×108cfu/g，之后再增大水分含量，則有所下降。由此可以看出，培養(yǎng)基水分含量過低使得基質(zhì)膨脹率降低，水分活度降低，從而抑制微生物的生長繁殖；而隨著水分含量的增加會使得培養(yǎng)基物料顆粒膨脹，空隙加大，有利于菌體從培養(yǎng)基中獲得營養(yǎng)和氧的傳遞，從而促進生長繁殖；但過高的水分含量會導(dǎo)致培養(yǎng)基黏結(jié)成團，多孔性降低，影響氧的傳遞進而使微生物生長能力降低。因而確定加水量為1.6倍。

2.1.3溫度對制曲的影響 以玉米黃粉為基質(zhì)，添加70%的麩皮并加入1.6倍的水配制種曲培養(yǎng)基，接入 5%的混合菌種，分別在 26、28、30、32、34 ℃條件下培養(yǎng)72 h后取樣測定種曲中的活菌總數(shù)，確定制曲溫度。結(jié)果如表3所示。

表3　不同制曲溫度對種曲中活菌總數(shù)的影響

由表3可知，在制曲過程中隨著溫度的升高活菌總數(shù)逐漸增高，在溫度為32℃時，種曲的活菌總數(shù)達到最大；隨著溫度繼續(xù)升高34℃時，活菌總數(shù)略有下降。說明溫度對微生物的生長起著很重要的作用，溫度低則菌種生長緩慢，而溫度過高會破壞菌體內(nèi)一些酶的活性，從而影響甚至殺死微生物。因此確定32℃為制曲溫度。

2.1.4培養(yǎng)時間對制曲的影響 微生物的生長及代謝產(chǎn)物的合成與培養(yǎng)時間密切相關(guān)。本試驗以玉米黃粉為基質(zhì)，添加70%的麩皮并加入1.6倍的水配制種曲培養(yǎng)基，接入5%的混合菌種，在32℃條件下進行種曲的制備。以培養(yǎng)時間24 h為起點，每隔12 h對種曲中的活菌總數(shù)進行檢測，以確定種曲的制備時間。結(jié)果如表4所示。

表4　種曲菌落總數(shù)隨制備時間的變化

由表4可知，在前48 h，微生物處于調(diào)整期，新接入的菌種需要適應(yīng)新的生長環(huán)境而導(dǎo)致菌種生長緩慢；48 h之后，微生物處于生長期，到84 h達到穩(wěn)定期，活菌總數(shù)達到最高；而后菌種逐漸進入平衡后期及衰退期，活菌總數(shù)逐漸降低。所以選擇84 h為種曲的制備時間。

2.1.5接種量對制曲的影響 以玉米黃粉為基質(zhì)，添加70%的麩皮并加入1.6倍的水配制種曲培養(yǎng)基，分別接入1%、2%、3%、5%、10%的混合菌種，在32℃條件下培養(yǎng)84 h后取樣測定種曲中的活菌總數(shù)，確定混合菌種的接種量。結(jié)果如表5所示。

表5　不同接種量對種曲活菌總數(shù)的影響

由表5可知，種曲中的活菌總數(shù)隨著接種量增加而增大。當接種量為3%～4%時，種曲中的活菌總數(shù)增幅最大；為4%～5%時，種曲中的活菌總數(shù)增幅雖有所減小但數(shù)量亦有明顯的增加；但當接種量為10%時種曲中活菌總數(shù)與5%相比并無明顯增加。由于接種量的加大會增加原料的成本，所以選擇5%為種曲制備的接種量。

2.2正交試驗結(jié)果分析 通過單因素試驗得出，制備種曲的條件是以玉米黃粉為基質(zhì)，添加70%的麩皮并加入1.6倍的水配制種曲培養(yǎng)基，接入5%的混合菌種，在32℃條件下培養(yǎng)84 h。在此基礎(chǔ)上設(shè)計了五因素四水平L16（45）的正交試驗，對各因素組合進行優(yōu)化。正交試驗設(shè)計和試驗結(jié)果如表6所示。

由表6中極差分析可以看出：RB＞RC＞RE＞RA＞RD，可知各因素對種曲制備的影響大小依次為加水量、接種量、制曲溫度、麩皮添加量和制曲時間。

由各水平的均值可得：加水量（B）中 K3＞K2＞K4＞K1；接種量（C）中 K3＞K4＞K2＞K1；制曲溫度（E）中 K2＞K3＞K1＞K4；麩皮添加量（A）中 K1＞K3＞K4＞K2；制曲時間（D）中 K3＞K1＞K2＞K4。 由此得出，采用混合菌種制備發(fā)酵玉米黃粉飼料種曲的最佳條件為B3C3E2A1D3，即：以玉米黃粉為基質(zhì)，添加80%的麩皮并加入1.6倍的水配制種曲培養(yǎng)基，接入5%的混合菌種，在30℃條件下培養(yǎng)84 h。

3　結(jié)論

以多菌種組合進行固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的種曲制備，通過單因素及正交試驗確定最佳制曲工藝條件為：以玉米黃粉為基質(zhì)，添加80%的麩皮并加入1.6倍的水配制種曲培養(yǎng)基，接入5%的混合菌種，在30℃條件下培養(yǎng)84 h。制備的種曲可用于發(fā)酵玉米黃粉生產(chǎn)蛋白飼料。

表6　正交試驗設(shè)計與結(jié)果

[1]胡明，侯樂海，王九菊，等.EM菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)米糠微生態(tài)產(chǎn)品的工藝優(yōu)化[J].糧食與飼料工業(yè)，2013，6：42 ～ 45，50.

[2]賈祥祥，郭興鳳.玉米蛋白粉的應(yīng)用研究進展[J].糧食加工，2011，2：60 ～ 67.