柴 俊， 朱 麗， 宋泉芝， 劉旭川， 張以芳， 許 琳， 普岳紅*

（1.云南農業(yè)大學省畜產品加工工程技術研究中心，云南昆明650201；2云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明650201）

芽孢桿菌（Bacillus），是一類能形成芽孢（內生孢子）的桿菌或球菌，為好氧或兼性厭氧的細菌，革蘭氏染色呈陽性。當外界環(huán)境發(fā)生改變時，菌體內的結構發(fā)生變化，經過前孢子階段，最終形成一個芽孢，對外界不良環(huán)境有很好的抵抗作用（劉秀花，2005）?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis)等芽孢桿菌在生長過程中會產生多種活性物質，對致病菌或內源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用，因其無毒、無害，被農業(yè)部允許作為飼料的添加劑，經常被制成微生物添加劑，用于改善動物腸道功能、促進動物生長和預防疾病（Fouad 等，2017；龔福明等，2009；李佳，2009；李晶等，2008）。本試驗對引進的樣品進行芽孢桿菌的分離鑒定，為微生物飼料添加劑的研究和利用提供科學基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料 飼料樣品及DH5α大腸桿菌為云南農業(yè)大學動物科學技術學院動物微生物實驗室引進保存。

1.2試劑 高保真Taq聚合酶、pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細胞和各種內切酶均為TAKARA公司產品，細菌DNA基因組提取試劑盒、純化回收試劑盒、質粒制備試劑盒均購自Bioteke公司。1.3 分離培養(yǎng)及染色鏡檢觀察 樣品經80℃高溫處理10～15 min。用無菌生理鹽水稀釋后傾注入芽孢富集培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，然后在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取不同形態(tài)特征的單個菌落，進行純培養(yǎng)及涂片染色鏡檢觀察。

1.4生化鑒定 按 《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版、第9版）中的方法對純培養(yǎng)細菌進行生理生化鑒定（Holt等，1994；布坎南等，1986）。

1.516S-rRNA擴增及測序 根據GenBank中芽孢桿菌的16S-rRNA的相關序列設計本研究的引物： 上游引物 PR：8-27 （5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’），下游引物 PF：1525-1541（5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’)，目的片段大小為1500bp左右。

細菌全DNA基因組的提?。喝》蛛x菌株的單個菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細菌對數生長期，用BIOTEKE公司細菌DNA提取試劑盒按說明書步驟，提取細菌總DNA，提取的DNA產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測結果，并初步估計其DNA含量。

PCR體系與反應條件：反應體系為50 μL：DNA 模板 4 μL， 10×PCR Buffer 5.0 μL，Ex Taq（5 U/μL)0.5 μL，dNTP mixture 4.0 μL， 上下游引物（20 μM）各 1 μL，ddH2O 34.5 μL。 PCR 反應程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃1 min，72 ℃1.5 min，共30個循環(huán)；72℃10 min；4℃ 保存。PCR結束后，取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測結果。

PCR擴增產物回收純化及克隆測序：參照BIOTEKE公司DNA純化試劑盒說明對PCR擴增的16S-rRNA產物進行純化回收。純化產物與pMD18-T載體連接構建重組質粒，將得到的重組質粒轉入到DH5α感受態(tài)細胞中，經氨芐抗性篩選、藍白斑篩選獲得陽性克隆，提取質粒。對重組質粒進行酶切和PCR鑒定，并將鑒定結果正確的重組質粒送TAKARA公司測序。

1.616S-rRNA同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 從GenBank中下載有關飼用微生物菌株及芽孢桿菌菌株的16S-rRNA代表序列作為參比序列。下載的序列信息見表1。利用DNAStar軟件對測得的序列及參比序列進行同源性比較。并利用ClusterX和Mega5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行系統(tǒng)進化親緣關系研究（Baindara等，2013；Leite等，2013）。

2　結果與分析

從樣品中分離到4株芽孢桿菌，分別命名為YB-1、YB-2、YB-3、YB-4， 經表型特性及 16S-rRNA序列分析，YB-1為蘇云金芽孢桿菌、YB-2、4為枯草芽孢桿菌、YB-3為蠟樣芽胞桿菌。其特性結合描述如下：

表1　飼用微生物中芽孢桿菌代表菌株的參比序列

2.1菌落特征 細菌在普通瓊脂平板上，YB-1為白色圓形菌落，邊緣整齊，表面透亮，濕潤，光滑，中央隆起，黏稠，直徑2～5 mm；YB-2為白色滴狀菌落，邊緣不整齊，中央微隆起，表面無光澤，干燥，直徑0.5～1 mm；YB-3為白色滴狀菌落，邊緣整齊，中央隆起，表面光滑濕潤，清亮，黏稠，直徑1.5～2mm；YB-4為白色圓形菌落，邊緣不整齊，表面無光澤，干燥如毛玻璃樣，直徑0.5 mm。

2.2形態(tài)特性 挑取單個菌落涂片染色后光鏡下觀察，菌落為桿狀呈簇狀或散在存在的革蘭氏陽性細菌。在不利環(huán)境下，形成芽孢。

2.3生化鑒定結果 細菌的生化鑒定結果為：（1）4株分離菌的接觸酶、運動性、葡萄糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、淀粉水解酶反應都呈應陽性；尿素水解酶、M.R試驗、吲哚試驗、卵磷脂試驗都呈陰性；（2）YB-2和YB-4分離菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇、V.P試驗、明膠液化試驗都是陽性；YB-1分離菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇、V.P試驗、明膠液化試驗都是陰性；YB-3分離菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇的試驗為陰性，V.P試驗、明膠液化試驗是陽性。生化試驗結果見表2。

2.3細菌16S-rRNA PCR擴增 4株菌株提取DNA，利用16S-rRNA引物PCR擴增，得到約1.5kb大小的目的片段，結果見圖1。

2.4重組質粒的PCR鑒定結果 將獲得的目的片段與pMD-18T載體連接，構建的重組質粒轉入DH5α感受態(tài)細胞中培養(yǎng)提取質粒，進行PCR鑒定，結果見圖2。

2.5重組質粒雙酶切鑒定結果 重組質粒用Bam HI、HindⅢ 進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見酶切后產生兩條帶，大小與預期相符，結果見圖3。

表2　生化試驗結果

圖1　四株芽孢桿菌的16S-rRNA基因擴增電泳圖

圖2　重組質粒及質粒PCR擴增電泳圖

圖3　重組質粒雙酶切電泳圖

2.616S-rRNA序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果 根據 YB-1、YB-2、YB-3、YB-4 的 16S-rRNA的測序結果，進行BLAST序列比對分析和系統(tǒng)進化樹分析。采用MEGA5軟件，分析4株分離菌與飼用微生物中芽孢桿菌的參比序列，繪制系統(tǒng)進化樹（見圖4）。4株分離菌與系統(tǒng)進化樹遠端的側孢芽孢桿菌的的同源性分別為88.35%、88.83%、89.68%和87.87%，表明分離菌與其遺傳距離較遠。YB-2、YB-4與枯草芽孢桿菌類群的B.subtilis HE937219的同源性分別為99.91%和100%，均在99%以上，且處于同一分支上，表明YB-2、YB-4屬于枯草芽孢桿菌。YB-1與蘇云金芽孢桿菌類群的B.thuringiensis AM292315的同源性為99.17%，在99%以上，處于同一分支，表明YB-1屬于蘇云金芽孢桿菌。YB-3與蠟樣芽孢桿菌類群的B.cereus NC_016771同源性為100%，表明YB-3屬于蠟樣芽孢桿菌。

圖4　4個分離株16S-rRNA與5個參比序列構建的進化樹

3　討論

細菌芽孢對外界環(huán)境不利于菌體生長的環(huán)境，如高溫、過酸等環(huán)境有較強的抵抗力。本試驗在樣品處理初期就經過80℃的高溫處理，除去了共生繁殖體的細菌，只有芽孢菌存活下來，使得試驗在初期分離細菌的過程中簡化了試驗時間和步驟。

目前國內外常用的飼用微生物種類主要有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、放線菌、光合細菌等幾大類（Fouad 等，2017；龔福明等，2009；李佳，2009；李晶等，2008）；其中芽孢桿菌主要有側孢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌等。本研究從引進的飼料樣品中分離到的芽孢桿菌種類有枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽孢桿菌，都是常用于飼料中的芽孢桿菌，可為本地微生物飼料添加劑的進一步發(fā)展提供研究基礎。

[1]布坎南RE，吉本斯RE.伯杰細菌鑒定手冊（第8版）[M].北京：科學出版社，1986.

[2]龔福明，柳陳堅，李海燕，等.枯草芽孢桿菌MN菌株由來膠原蛋白酶的純化與生化性質[J].上海交通大學學報（農業(yè)科學版），2009，28（6）：572 ～ 577.

[3]李佳.枯草桿菌特征和應用現狀[J].肉類研究.2009，129（11）：18～21.

[4]李晶，楊謙.生防枯草芽孢桿菌的進展研究[J].安徽農業(yè)科學.2008，36（1）：106 ～ 111.

[5]劉秀花.芽孢桿菌的應用研究和進展 [J].商丘師范學院學報.2005，21（5）：135 ～ 137.

[6]Baindara P，Santi M Mandal，Chawla N，et al.Characterization of two antimicrobial peptides produced by a halotolerant Bacillus subtilis strain SK.DU.4 isolated from a rhizosphere soil sample[J].AMB Express 2013，3：2.

[7]Fouad M，Elshaghabee F，Rokana N，et al；Bacillus As Potential Probiotics：Status，Concerns，and Future Perspectives[J].Frontiers in Microbiology 2017，8：1490 ～ 1505.

[8]Leite HA，Silva AB，Gomes FP，et al.Bacillus subtilis and Enterobacter cloacae endophytes from healthy Theobroma cacao L.trees can systemically colonize seedlings and promote growth[J].APPL Microbiol Biotechnol，2013，97（6）：2639 ～ 2651.