汪開銀，熊曉輝，游京晶，陸利霞，盧一辰，陳　斌

(1.國家輕工業(yè)食品質(zhì)量監(jiān)督檢測南京站，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800)

蘇丹紅(Sudan)是一類親脂性偶氮化合物，屬于人工合成的紅色工業(yè)染料，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為蘇丹紅Ⅰ(C16H12N2O)、蘇丹紅Ⅱ(C18H16N2O)、蘇丹紅Ⅲ(C22H16N4O)和蘇丹紅Ⅳ(C24H20N4O)[1]。由于蘇丹紅具有染紅其他食品的功能且價格低廉，一些廠家把蘇丹紅添加到辣椒醬、辣椒油、辣椒粉和紅心鴨蛋等食品中，以達(dá)到食品長期保持鮮紅、不易褪色的目的。大量研究表明，短期內(nèi)攝入大量蘇丹紅會導(dǎo)致死亡，長期食用蘇丹紅引發(fā)體內(nèi)蓄積性毒性，致使機(jī)體器官損傷或基因突變，繼而誘發(fā)癌癥[1-3]。多項(xiàng)蘇丹紅的“三致”實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘇丹紅化學(xué)成分中含有一種萘的化合物，其具有偶氮結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)分解形成芳香胺化合物，使動物致癌，同時對人類也顯現(xiàn)出較高的致癌風(fēng)險[4]。多年前發(fā)生的蘇丹紅事件給中國社會和民眾帶了很大沖擊，2006年，我國發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單(第一批)》中蘇丹紅被列為了嚴(yán)禁添加的非食用物質(zhì)。目前，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將蘇丹紅Ⅰ歸類為三級致癌物和遺傳毒性物質(zhì)，歐盟也發(fā)布了辣椒制品里禁止非法添加蘇丹紅染料的禁令[5]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于蘇丹紅的快速檢測技術(shù)主要包括薄層層析比色法、酶聯(lián)免疫技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)和膠體金免疫層析技術(shù)[6-9]。此4種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)：其中，薄層層析比色法不需要使用復(fù)雜儀器，可實(shí)現(xiàn)快速、簡單測定，但樣品處理較為復(fù)雜，且靈敏度低；酶聯(lián)免疫技術(shù)具有檢測速度快、成本低和目標(biāo)選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其操作過程較為繁瑣，結(jié)果重復(fù)性較差，且需要使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，該儀器價格昂貴且不便于攜帶，難以滿足現(xiàn)場檢測的要求；表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)雖可實(shí)現(xiàn)快速、簡單測定，但易受基體影響；膠體金免疫層析技術(shù)具有快速、靈敏、簡單、低成本和無需大型儀器等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品中殘留物的分析，聯(lián)合國糧農(nóng)組織已向許多國家推薦該項(xiàng)技術(shù)，美國化學(xué)會將免疫分析技術(shù)與色譜技術(shù)共同列為農(nóng)、獸藥殘留分析的主要技術(shù)[10-12]。目前我國市場上已有利用此技術(shù)的商品化試劑盒，但是，這些商品化試劑盒因?yàn)槭苁称方橘|(zhì)影響較大，特別是辣椒制品中色素和油脂的干擾，導(dǎo)致檢測靈敏度低，無法滿足要求。因此，本研究中，筆者選擇膠體金免疫層析技術(shù)作為蘇丹紅Ⅰ的快速檢測技術(shù)，對辣椒制品的前處理方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，使其適于在快速檢測中推廣使用。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1樣品來源

辣椒醬、辣椒油和辣椒粉均購自南京本地超市，經(jīng)GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法高效液相色譜法》測試，本底不含蘇丹紅類化合物。

1.1.2主要試劑和儀器

乙腈、無水MgSO4、正己烷、二氯甲烷、NaOH、無水乙醇(AR)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；固相萃取柱(CNW Poly-sery MIP-SDR，200 mg/3 mL)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；蘇丹紅Ⅰ膠體金免疫層析試劑盒(內(nèi)含金標(biāo)微孔和試紙條)，深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司；蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品(≥99.0%)，德國DR公司。

QL-866型渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GL-20G-Ⅱ型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DC-24型氮吹儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；HH-2型水浴鍋，國華電器有限公司。

1.2　方法與檢測原理

本文中選擇的膠體金免疫層析技術(shù)采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的蘇丹紅 Ⅰ 經(jīng)過前處理提取后，可以與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和檢測線(T線)上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線(C線)顏色深淺比較，對樣品中蘇丹紅 Ⅰ 進(jìn)行定性判定。

1.3　實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1前處理方法

1)直接提取法

稱取樣品2 g于15 mL離心管中，加入10 mL正己烷，渦旋振蕩后離心。轉(zhuǎn)移全部上清液于10 mL離心管中，吹干后加入400 μL 25%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，渦旋混勻后，待測定。

2)固相萃取柱方法

稱取樣品2 g于15 mL離心管中，加入正己烷提取液，渦旋振蕩后離心。將全部上清液加入到固相萃取柱中，流出液棄去。再加入正己烷淋洗固相萃取柱，流出液棄去。用二氯甲烷洗脫固相萃取柱，收集洗脫液吹干。加入400 μL 25%乙醇溶液，渦旋混合后，待測定。

3)皂化法

稱取樣品2 g于15 mL離心管中，加入正己烷提取，渦旋振蕩后離心。轉(zhuǎn)移全部上清液于10 mL離心管中，吹干后加入NaOH溶液，渦旋混勻后置于80 ℃水浴皂化。再加入正己烷，渦旋萃取后離心，轉(zhuǎn)移上清液于新的10 mL離心管中，加入無水MgSO4，渦旋振蕩后離心，轉(zhuǎn)移上清液于10 mL離心管中吹干。加入400 μL 25%乙醇溶液，渦旋混合后，待測定。

1.3.2試劑條測定方法

吸取200 μL待測液于金標(biāo)微孔中，抽吸10次使混合均勻，室溫溫育5 min，將試紙條吸水海綿端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，溫育8 min，從微孔中取出試紙條，進(jìn)行結(jié)果判定：檢測線(T線)顏色比控制線(C線)顏色深或者檢測線(T線)顏色與控制線(C線)顏色相當(dāng)，表明樣品中蘇丹紅Ⅰ低于方法檢測限，判定為陰性；檢測線(T線)不顯色或檢測線(T線)顏色比控制線(C線)顏色淺，表明樣品中蘇丹紅Ⅰ的含量高于方法檢測限，判定為陽性；控制線(C線)不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。

1.3.3實(shí)驗(yàn)方法學(xué)研究

1)產(chǎn)品方法性能指標(biāo)的測定

稱取以辣椒醬、辣椒油和辣椒粉為代表的空白基質(zhì)樣品，添加蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液制成添加水平為0、5、10 和20 μg/kg的盲樣樣品各50份，共計600份樣品。按上述前處理方法和測定方法進(jìn)行測定。

2)交叉反應(yīng)

稱取以辣椒醬、辣椒油和辣椒粉為代表的空白基質(zhì)樣品，分別添加蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅、新紅、日落黃、檸檬黃、酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22、靛藍(lán)和亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成添加水平為0、10、20、50、100、200、500和1 000 μg/kg的系列樣品，按上述前處理方法和測定方法進(jìn)行測定，考察試劑盒與上述化合物的交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)率(CR)的計算見式(1)。

CR=(蘇丹紅Ⅰ最低檢出限/其他物質(zhì)最低檢出限)×100%

(1)

3)與參比方法一致性

稱取以辣椒醬、辣椒油和辣椒粉為代表的空白基質(zhì)樣品，蘇丹紅Ⅰ添加量為10 μg/kg 的盲樣樣品各40份。其中20份按上述前處理方法和測定方法進(jìn)行測定，另外20份以GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法高效液相色譜法》作為參比方法，對方法一致性進(jìn)行研究。

4)快檢方法驗(yàn)證

根據(jù)方法驗(yàn)證要求，南京工業(yè)大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所和山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院3家方法驗(yàn)證單位對食品中蘇丹紅Ⅰ的快速檢測方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)評價以辣椒醬、辣椒油和辣椒粉作為空白基質(zhì)，經(jīng)儀器方法確證為陰性。以辣椒醬、辣椒油和辣椒粉作為空白基質(zhì)制成的盲樣，盲樣中蘇丹紅Ⅰ含量分別為0、5、10和20 μg/kg 4個添加水平的盲樣樣品，每個添加水平平行制備20份，每種基質(zhì)每家驗(yàn)證單位盲樣樣品80份，每家驗(yàn)證單位共計240份盲樣樣品，3家驗(yàn)證機(jī)構(gòu)共計720份加盲樣樣品，以盲樣形式寄送給3家方法驗(yàn)證單位，辣椒醬和辣椒油用固相萃取法進(jìn)行前處理，辣椒粉用皂化法進(jìn)行前處理，并用膠體金試劑條方法進(jìn)行測定。

2　結(jié)果與討論

2.1　提取試劑的優(yōu)化

蘇丹紅不溶于水，易溶于有機(jī)試劑，所以選擇最常用的3種有機(jī)試劑正己烷、丙酮和乙腈作為蘇丹紅提取試劑進(jìn)行優(yōu)化。

選取加標(biāo)為500 μg/kg的辣椒醬樣品，通過直接提取法：有機(jī)試劑提取、離心、取上清液吹干，復(fù)溶液復(fù)溶檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知：提取效果最好的是正己烷，其次是乙腈，丙酮提取效果相對較差，所以選擇正己烷作為提取試劑。

圖1　　　　不同提取試劑的檢測結(jié)果Fig.1　　　　Detection results of different extraction reagents

2.2　提取方法的比較

稱取以辣椒醬、辣椒油和辣椒粉為代表的空白基質(zhì)樣品，添加蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制成添加水平為0、5、10、20、50、100、200 、500和1 000 μg/kg 的加標(biāo)樣品，分別用直接提取法、固相萃取法和皂化法進(jìn)行前處理，膠體金試劑條進(jìn)行檢測，以檢出陽性結(jié)果最低值作為其檢測限，結(jié)果見表1。

表1　前處理方法的檢測限比較

表1結(jié)果顯示：直接提取法在檢測辣椒醬、辣椒油和辣椒粉時，檢測限較高，無法滿足檢測要求；固相萃取法適用于辣椒醬和辣椒油的檢測，檢測限可以達(dá)到10 μg/kg；皂化法適用于辣椒粉的檢測，檢測限可以達(dá)到10 μg/kg。圖2為辣椒醬、辣椒油和辣椒粉中蘇丹紅Ⅰ添加量為10 μg/kg的檢測結(jié)果。

圖2　　　　蘇丹紅Ⅰ添加量為10 μg/kg的檢測結(jié)果Fig.2　　　　Detection results of 10 μg/kg Sudan red Ⅰ addition dose

2.3　產(chǎn)品方法性能指標(biāo)的測定

稱取以辣椒醬、辣椒油和辣椒粉為代表的空白基質(zhì)樣品，添加蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液制成添加水平為0 、5、10 和20 μg/kg的盲樣樣品各50份，共計600份樣品。按照上述前處理方法進(jìn)行測定。進(jìn)一步對方法性能進(jìn)行評價，結(jié)果如表2～4所示。

表2　方法性能指標(biāo)計算表(辣椒醬)

表3　方法性能指標(biāo)計算表(辣椒油)

表4　方法性能指標(biāo)計算表(辣椒粉)

對于辣椒醬、辣椒油和辣椒粉基質(zhì)陽性樣品來說，均檢出100個陽性結(jié)果，假陰性率均為0；對于陰性樣品來說，也均檢出100個陰性結(jié)果，假陽性率為0。同時，辣椒醬、辣椒油和辣椒粉基質(zhì)樣品靈敏度均為100%，特異性均為100。

2.4　交叉反應(yīng)結(jié)果

當(dāng)蘇丹紅Ⅲ添加水平高至500 μg/kg時，蘇丹紅Ⅰ試劑盒檢測均檢出陽性，表明本方法試劑盒與蘇丹紅Ⅲ有交叉反應(yīng)，且交叉反應(yīng)率為2%。

蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅳ、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅、新紅、日落黃、檸檬黃、酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22、靛藍(lán)和亮藍(lán)添加水平至1 000 μg/kg時，蘇丹紅 Ⅰ 試劑盒檢測均檢出陰性，表明本方法試劑盒均與上述試劑無交叉反應(yīng)。

2.5　與參比方法一致性分析

在檢測限濃度水平(10 μg/kg)時，膠體金試劑盒方法測定結(jié)果與參比方法檢測結(jié)果完全一致，具體結(jié)果見表5。由表5可知，膠體金試劑盒方法結(jié)果均與參比方法一致，符合方法一致性要求。

表5　與參比方法一致性分析情況

2.6　驗(yàn)證結(jié)果與匯總

3家方法驗(yàn)證單位的驗(yàn)證結(jié)果見表6～8，其中，甲為南京工業(yè)大學(xué)，乙為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，丙為山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院。由表6～8可知：以辣椒醬、辣椒油和辣椒粉作為空白基質(zhì)時，本方法的特異性均為87.5%～100%，靈敏度均為100%，假陽性率均≤12.5%，假陰性率均為0，符合食藥監(jiān)科便函[2017]43號《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》的技術(shù)要求。

表6　方法性能指標(biāo)計算表(辣椒醬)

表7　方法性能指標(biāo)計算表(辣椒油)

注：丙結(jié)果中的一個陽性樣品檢測結(jié)果為失效。

3　結(jié)論

選用辣椒制品中的辣椒醬、辣椒油和辣椒粉作為空白基質(zhì)，對蘇丹紅Ⅰ膠體金快速檢測試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行方法學(xué)研究。研究表明：直接提取法在檢測辣椒醬、辣椒油和辣椒粉時，檢測限較高，無法滿足檢測要求；固相萃取法適用于辣椒醬和辣椒油的檢測，檢測限可以達(dá)到10 μg/kg；皂化法適用于辣椒粉的檢測，檢測限可以達(dá)到10 μg/kg。該方法的靈敏度為100%，特異性為87.5%～100%，假陽性率為12.5%，假陰性率為0，上述性能指標(biāo)均符合食藥監(jiān)科便函[2017]43號《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》的技術(shù)要求。交叉反應(yīng)率結(jié)果顯示蘇丹紅Ⅲ與本方法試劑盒有交叉反應(yīng)，且交叉反應(yīng)率為2%；蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅳ、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅、新紅、日落黃、檸檬黃、酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22、靛藍(lán)和亮藍(lán)與本方法試劑盒均無交叉反應(yīng)。同時，與參比方法進(jìn)行一致性分析比較時，結(jié)果表明與參比方法陽性確證比例在 95% 的置信區(qū)間內(nèi)沒有統(tǒng)計學(xué)差異或完全一致。因此本方法適用于辣椒制品中蘇丹紅Ⅰ的快速檢測。

參考文獻(xiàn)：

[3]官佳懿,谷崇高,沈紅,等.蘇丹紅致小鼠氧化損傷的研究[J].毒理學(xué)雜志,2014,28(2):141-144.

[4]張玉黔,欒燕,王新麗,等.反相高效液相色譜法測定食品中蘇丹紅 1,2,3,4 的方法研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(7):807-808.

[5]國家衛(wèi)生部.蘇丹紅危險性評估報告[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2005,17(3):276-278.

[6]王躍群.中成藥中 “蘇丹紅” 的檢測方法研究[J].湖北中醫(yī)雜志,2012,34(4):71-72.

[7]蘇小川,黃梅,甘賓賓,等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定調(diào)味品中蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ色素[J].理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊),2006,42(12):1003-1006.

[8]魏晉梅,曹祿興.高效液相色譜法檢測蛋禽飼料中的蘇丹紅 I[J].飼料工業(yè),2008,29(6):57-58.

[9]張云,李今中,鄭敬峰,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測番茄制品中蘇丹紅[J].分析試驗(yàn)室,2012,31(12):78-81.

[10]LIU Y,SONG Z,DONG F,et al.Flow injection chemiluminescence determination of Sudan Ⅰ in hot chilli sauce[J].J Agric Food Chem,2007,55(3):614-617.

[11]WANG Y,WEI D,YANG H,et al.Development of a highly sensitive and specific monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of Sudan Ⅰ in food samples[J].Talanta,2009,77(5):1783-1789.

[12]HUANG H Y,SHIH Y C,CHEN Y C.Determining eight colorants in milk beverages by capillary electrophoresis[J].J Chromatogr A,2002,959(1):317-325.