方　昕，徐春祥，顏春榮，吳小芹

(1.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210008；2.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

轉(zhuǎn)基因生物是指利用DNA重組技術(shù)，將外源基因?qū)胧荏w基因組，從而使受體獲得某種新的性狀而得到的生物[1]。以轉(zhuǎn)基因生物為原料加工生產(chǎn)得到的食品為轉(zhuǎn)基因食品。合理運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以培育具有優(yōu)良特性的作物新品種，從而提高單位面積產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)，減少作物對(duì)農(nóng)藥的依賴，降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，提高經(jīng)濟(jì)效益[2-4]。

1994年，美國(guó)首次批準(zhǔn)耐儲(chǔ)存的轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)入市場(chǎng)銷售，隨后，抗蟲棉花、抗除草劑大豆、抗蟲玉米和油菜等一系列具有改良性狀的轉(zhuǎn)基因作物相繼在多個(gè)國(guó)家開始大規(guī)模種植[5]。自1996年起，全世界種植轉(zhuǎn)基因作物面積逐年遞增，2016年達(dá)1.85億公頃(圖1)，覆蓋全球26個(gè)國(guó)家[6]。截至2016年，我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物面積為280萬公頃，占世界種植面積的2%[6]。我國(guó)的轉(zhuǎn)基因作物主要有兩種來源途徑，一類是農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)商業(yè)化種植和生產(chǎn)的作物，包括抗蟲棉花和抗病毒番木瓜；另一類是經(jīng)過安全評(píng)價(jià)審批的進(jìn)口轉(zhuǎn)基因作物，包括玉米、大豆、油菜、甜菜和棉花。

圖1　　　　1996—2016年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積[6](百萬公頃)Fig.1　　　　Global area of GM crops from 1996 to 2006[6] (million hectares)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在帶來產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)效益大幅提升的同時(shí)，其產(chǎn)品安全性卻一直備受爭(zhēng)議[7]。針對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的潛在風(fēng)險(xiǎn)，全面且嚴(yán)格的監(jiān)管措施不可或缺，而精準(zhǔn)的檢測(cè)和科學(xué)評(píng)估則是轉(zhuǎn)基因食品監(jiān)管重要的技術(shù)基礎(chǔ)。因此，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的科學(xué)評(píng)估和準(zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品監(jiān)管有著重要的意義。

轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法可以從核酸、轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)及表型等層面進(jìn)行探索?；虻男薷目梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)錄水平的方法來檢測(cè)，如合成新的轉(zhuǎn)錄子或RNA沉默[8]。然而，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控容易受到外在環(huán)境條件的影響，并且，在生物不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段，同一基因的轉(zhuǎn)錄水平也不盡相同，這些因素容易干擾檢測(cè)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。外源基因的表達(dá)蛋白，也可以作為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的目標(biāo)物。然而，基于蛋白的檢測(cè)技術(shù)有一定的局限性：首先，檢測(cè)對(duì)象中必須含有已知蛋白，抗體制備困難大，制備周期長(zhǎng)，不適合新品種轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)；其次，檢測(cè)的準(zhǔn)確性受到樣品基質(zhì)的影響，不適合深加工或復(fù)雜樣品；再次，和核酸檢測(cè)技術(shù)相比，蛋白類方法靈敏度較低，不適合轉(zhuǎn)基因成分較少的樣品[9]。轉(zhuǎn)基因作物新表型的出現(xiàn)往往也可以作為判斷轉(zhuǎn)基因的依據(jù)，但是，這種方法需要對(duì)植物進(jìn)行培育和觀察，不僅周期長(zhǎng)，同時(shí)還需要排除自發(fā)突變株干擾，因此，并不適合作為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分的技術(shù)[10]。

實(shí)踐中， 基于核酸的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)因其較高的靈敏度和良好的特異性而獲得廣泛認(rèn)可和應(yīng)用[11-13]。本文中，筆者主要針對(duì)當(dāng)今國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因成分的核酸分析檢測(cè)技術(shù)的原理、應(yīng)用及方法評(píng)價(jià)進(jìn)行綜述，以期為轉(zhuǎn)基因食品的分析檢測(cè)提供更多思路。

1　檢測(cè)技術(shù)

1.1　目標(biāo)基因選擇策略

依據(jù)核酸目標(biāo)序列的位置和特征，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)可以分為外源基因特異性(gene specific)檢測(cè)、篩選/元件特異性(screeing/element specific)檢測(cè)、構(gòu)建特異性(construct specific)檢測(cè)和轉(zhuǎn)化事件特異性(event specific)檢測(cè)[10]。外源基因特異性檢測(cè)是以插入的外源基因?yàn)闄z測(cè)靶序列，此方法不能區(qū)別導(dǎo)入相同外源基因的不同作物及品系，具有一定的局限性。篩選/元件特異性檢測(cè)是以CaMV35S啟動(dòng)子、nos終止子等轉(zhuǎn)錄元件或者標(biāo)記作為檢測(cè)靶序列，此方法可以對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行快速篩選。構(gòu)建特異性檢測(cè)的目標(biāo)序列是外源基因和轉(zhuǎn)錄元件的鏈接區(qū)域，然而，該方法不能區(qū)別包含相同外源基因的不同轉(zhuǎn)基因品系，不能提供具體的轉(zhuǎn)基因品系信息[14]。轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)的目標(biāo)序列是導(dǎo)入的外源DNA與受體結(jié)合位點(diǎn)邊界的序列。該方法包含了受體信息和轉(zhuǎn)基因構(gòu)建信息，不僅確定了外源基因的插入位點(diǎn)，還明確了外源基因的拷貝數(shù)，是目前特異性最高的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)[15]。

1.2　常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

PCR是核酸檢測(cè)中最常用的方法，目前該方法的研究成熟、應(yīng)用廣泛，常見的PCR方法包括常規(guī)PCR、巢式PCR(nested PCR)、多重PCR(multiplex PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)等。

常規(guī)PCR是在DNA聚合酶作用下，經(jīng)過變性、退火和延伸3個(gè)步驟的循環(huán)而達(dá)到DNA擴(kuò)增的技術(shù)，是定性判斷轉(zhuǎn)基因成分的最簡(jiǎn)單有效的方法之一。該方法特異性好、靈敏度高、速度快，早在2003年就被我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)列為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。

巢式PCR是利用內(nèi)、外兩對(duì)引物的PCR反應(yīng)。第一對(duì)引物(外引物)擴(kuò)增片段與常規(guī)PCR相似，第二對(duì)引物(內(nèi)引物)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部。巢式PCR的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是錯(cuò)配率低、特異性高，兩輪PCR引物不同，降低了非特異性反應(yīng)被連續(xù)放大的可能性；二是靈敏度高，兩輪PCR克服了單次擴(kuò)增平臺(tái)期效應(yīng)的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA被破壞的深加工食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。Ao等[16]采用多重巢式PCR 檢測(cè)了深加工食品中大米、玉米和大豆轉(zhuǎn)基因成分,靈敏度高達(dá)到0.005%。Brod等[17]運(yùn)用巢式PCR 技術(shù)成功檢測(cè)出大豆制品中的轉(zhuǎn)基因成分。該方法的缺點(diǎn)在于操作步驟多，增加了污染的幾率，假陽性可能性較大。

多重PCR 是在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物、同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)序列的PCR反應(yīng)。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于快速高效，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，適合識(shí)別包含受體信息和外源信息的轉(zhuǎn)化事件，曾一度成為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)研究的熱點(diǎn)。Cheah等[18]開發(fā)出以EPSPS和Cry1Ab為目標(biāo)基因的大豆及玉米轉(zhuǎn)基因成分的多重PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)限達(dá)0.25%。在歐洲，多重PCR被用來同時(shí)篩選多種轉(zhuǎn)基因食品或作物，檢測(cè)過程高效，結(jié)果準(zhǔn)確[19-20]。多重PCR技術(shù)的難點(diǎn)在于引物的設(shè)計(jì)，必須保證各對(duì)引物的特異性，多對(duì)引物之間不形成引物二聚體，多對(duì)引物最佳退火溫度接近。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，通過添加熒光染料或者使用熒光探針來實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增反應(yīng)過程的技術(shù)。常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要有兩類：一是TaqMan探針法，其原理是利用雙熒光標(biāo)記的TaqMan探針解離產(chǎn)生的熒光來監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物；二是熒光染料法，常用的染料為SYBR Green，其原理是利用染料分子與雙鏈DNA特異性結(jié)合而產(chǎn)生熒光來監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)。Kaur等[21]運(yùn)用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR成功檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因玉米中8個(gè)外源基因。K?ppel等[22]建立了以大豆和玉米為原料的轉(zhuǎn)基因食品多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。和常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR有兩點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：一是可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，無需產(chǎn)物分析步驟，檢測(cè)過更加簡(jiǎn)便快速；二是可以通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的定量分析。目前，熒光定量PCR方法已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外最常用的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法。盡管如此，該方法還是受到儀器設(shè)備的限制，不適合快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1.3　數(shù)字PCR (Digital PCR)

數(shù)字PCR是繼常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR之后，可以絕對(duì)定量核酸拷貝數(shù)的第三代PCR技術(shù)。該技術(shù)將樣品分散到數(shù)萬個(gè)反應(yīng)單元中，使得反應(yīng)單元僅包含模板單分子，并在反應(yīng)結(jié)束后收集各反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，最后通過統(tǒng)計(jì)學(xué)原理計(jì)算樣品中核酸的含量[23]。目前常見的數(shù)字PCR主要有兩大類，一是芯片數(shù)字PCR，二是微滴數(shù)字PCR。前者利用芯片上的數(shù)萬個(gè)微孔將樣品模板單分子化，后者是將擴(kuò)增體系分散為數(shù)百萬油狀液體包裹的小液滴，從而實(shí)現(xiàn)樣品模板單分子化。

2013年，Morisset等[24]運(yùn)用數(shù)字PCR對(duì)食品及飼料中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了精確的定量分析。Dobnik等[25]基于微滴數(shù)字PCR技術(shù),建立了針對(duì)歐盟授權(quán)的12 種轉(zhuǎn)基因玉米品系轉(zhuǎn)基因成分的多重定量分析方法。Iwobi等[26]運(yùn)用微滴數(shù)字PCR快速分析不同食品的轉(zhuǎn)基因成分含量，檢出限可達(dá)到0.1%。

和熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR不依賴擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析。同時(shí)，該技術(shù)結(jié)合了熒光定量PCR和高通量檢測(cè)，為大量樣本篩選提供了技術(shù)支持，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方面具有較大的應(yīng)用前景。

1.4　等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是指在恒定溫度下對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。與常規(guī)的PCR相比，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要DNA的熱變形和溫度的循環(huán)，在較低的溫度下就能實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。根據(jù)單鏈模板形成的方式不同，等溫?cái)U(kuò)增可以分為以下4類[27]：① 鏈置換DNA聚合酶介導(dǎo)的反應(yīng)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA);② 酶促解旋引物退火反應(yīng)，如依賴解旋酶的擴(kuò)增(HDA)、重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(RPA)；③ 基于RNA轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增，如轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)；④ 需要單鏈剪切酶輔助的反應(yīng)，如鏈置換擴(kuò)增(SDA)。

LAMP技術(shù)由日本Eiken公司[28]2000年研發(fā)，該技術(shù)利用特殊設(shè)計(jì)的4條引物，特行性地識(shí)別DNA模板上的6個(gè)區(qū)域，在聚合酶作用下，外側(cè)引物延伸使得內(nèi)側(cè)引物形成的子鏈脫離，從而再生出新的引物結(jié)合位點(diǎn)，繼而引發(fā)新的擴(kuò)增。LAMP的擴(kuò)增效率高，可在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物及副產(chǎn)物，從而衍生出了濁度法、鈣黃綠素法和SYBR Green熒光法等產(chǎn)物分析方法。其中，比較常見的是濁度法，LAMP擴(kuò)增中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物焦磷酸根離子能夠與反應(yīng)液中的Mg2+結(jié)合生成沉淀，大量累積時(shí)就會(huì)形成肉眼可見的渾濁。和常規(guī)PCR相比，LAMP具有靈敏度高、特異性高、不依賴精密儀器和結(jié)果判讀快速等優(yōu)點(diǎn)。該方法簡(jiǎn)化了擴(kuò)增產(chǎn)物分析的步驟，適合快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。閆興華等[29]以cordapA作為靶基因設(shè)計(jì)4條引物，運(yùn)用LAMP技術(shù)在50 min內(nèi)成功檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因玉米LY038。

SDA是利用限制性內(nèi)切酶活性和具有鏈置換活性DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)的擴(kuò)增反應(yīng)。SDA在兩對(duì)引物和兩種功能酶的作用下，通過“酶切-延伸-替代”的循環(huán)方式使靶序列得以擴(kuò)增。

NASBA是基于RNA的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。模板RNA逆轉(zhuǎn)錄形成RNA-DNA雜交體，RNase H酶降解雜交體的RNA，單鏈DNA作為模板合成新的雙鏈DNA，后者被T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出靶RNA，由此進(jìn)入新一輪擴(kuò)增循環(huán)，不斷形成靶核酸分子[30]。Morisset等[31]利用NASBA技術(shù)建立了轉(zhuǎn)基因玉米MON863和MON810的多重檢測(cè)方法，證明了該技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方面的可應(yīng)用性。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)，降低了檢測(cè)過程對(duì)設(shè)備的要求，并使得檢測(cè)結(jié)果可視化。但該方法設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，檢測(cè)成本高，也在一定程度上限制了其應(yīng)用發(fā)展。

1.5　側(cè)翼序列PCR 技術(shù)

側(cè)翼序列是指目標(biāo)基因兩側(cè)的DNA序列，其中包含著許多重要的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控因子。在轉(zhuǎn)基因作物研究中，外源基因插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列對(duì)目的基因的正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有著重要影響。傳統(tǒng)的側(cè)翼序列分析方法包括反向PCR[32]、連接介導(dǎo)PCR[33]、交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR(Tail-PCR)[34-36]、隨機(jī)引物PCR[37]和特異連接PCR[38]等。

反向PCR是將基因組酶切破碎，通過環(huán)化實(shí)現(xiàn)反向引物擴(kuò)增，最后測(cè)序判斷產(chǎn)物序列信息的一項(xiàng)技術(shù)[9]。反向PCR 可以快速擴(kuò)增一個(gè)已知基因片段的兩側(cè)序列。由于側(cè)翼序列位置，因此選擇合適的內(nèi)切酶是該技術(shù)的關(guān)鍵。Zimmermann等[32]通過反向PCR獲得了轉(zhuǎn)基因玉米bt11基因5′端序列，從而建立了轉(zhuǎn)基因玉米定量競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)。Xu等[39]運(yùn)用反向PCR技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因大豆的側(cè)翼序列，建立出一套成熟的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法。

Tail-PCR是利用3個(gè)嵌套的特異性引物，分別和1個(gè)低Tm值的簡(jiǎn)并引物組合，進(jìn)行連續(xù)的PCR循環(huán)反應(yīng)，利用不同的退火溫度選擇性地?cái)U(kuò)增靶序列[40]。Tail-PCR技術(shù)簡(jiǎn)單易行，反應(yīng)高效，靈敏度高，產(chǎn)物的特異性高。邵彥春等[41]運(yùn)用該技術(shù)分離到紅曲霉色素突變株T-DNA的側(cè)翼序列，獲得了一個(gè)類似發(fā)育調(diào)控子基因的序列。Wang等[36]運(yùn)用Tail-PCR分析了轉(zhuǎn)基因水稻外源基因插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，依據(jù)轉(zhuǎn)化事件PCR原理開發(fā)出高特異性的轉(zhuǎn)基因水稻鑒定方法。

近年來，隨著第二代高通量測(cè)序(NGS)的發(fā)展，側(cè)翼序列PCR有了進(jìn)一步的發(fā)展[42]，先后出現(xiàn)了long template-rapid amplification of genomic DNA ends (LT-RADE)[43-44]、位點(diǎn)搜索PCR(site finding-PCR)[45]和隨機(jī)破碎片段PCR (randomly broken fragment PCR,RBF-PCR)[45]等技術(shù)。

隨機(jī)破碎片段PCR的原理是利用超聲破碎的方法獲得基因小片段，兩端平端化處理后在3′端添入堿基A，利用通用接頭進(jìn)行染色體步移[9]。該技術(shù)已經(jīng)被成功用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米LY038中未知的側(cè)翼序列，該方法不依賴于酶切位點(diǎn)的選擇，適用于所有種類的轉(zhuǎn)基因品系，具有很高的應(yīng)用價(jià)值[46]。

LT-RADE是一種基于引物延伸來識(shí)別外源基因側(cè)翼序列的方法[43-44]。和傳統(tǒng)的RADE相比，LT-RADE可以延伸出800～1 000 bp的長(zhǎng)DNA片段。該方法分為單引物延伸、產(chǎn)物純化、同聚物加尾和兩次巢式PCR共5個(gè)步驟，運(yùn)用此法可以檢測(cè)出樣品中微量的轉(zhuǎn)基因成分，但其特異性還有待提高[43]。

1.6　核酸檢測(cè)試紙條技術(shù)

免疫層析試紙條是常用的快速檢測(cè)方法之一。該方法基于免疫學(xué)原理，結(jié)合層析法，能夠快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地篩選到目標(biāo)物。常見的免疫層析試紙是以蛋白為抗原抗體進(jìn)行特異性反應(yīng)的，但由于核酸相較于蛋白更加穩(wěn)定，因此，近年來基于免疫學(xué)原理的核酸試紙條技術(shù)受到了越來越多的關(guān)注[47]。

核酸試紙條可以結(jié)合多種PCR技術(shù)，用異硫氰酸熒光素(FITC)、地高辛(DIG)或生物素(biotin)等標(biāo)記引物或探針獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物作為抗原，膠體金和檢測(cè)線處分別標(biāo)記親和素、抗熒光素等相應(yīng)抗體，通過抗原抗體特異性結(jié)合獲得可視化的檢測(cè)結(jié)果[48]。Woo等[49]用雙重PCR 結(jié)合一次性核酸試紙條檢測(cè)了含轉(zhuǎn)基因玉米59122 的玉米粉中的外源CaMV35S啟動(dòng)子和內(nèi)源基因SSIIb，檢測(cè)限為1%。Kolm等[50]結(jié)合恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，用核酸試紙條檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物中的外源CaMV35S啟動(dòng)子，結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)一致。

然而，核酸試紙條技術(shù)尚不成熟，在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些缺點(diǎn)和限制[51]。第一，方法的特異性和準(zhǔn)確度還有待提高。擴(kuò)增中引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的假陽性，擴(kuò)增效率不高則會(huì)造成結(jié)果的假陰性。第二，該技術(shù)依賴于核酸的提取及PCR儀的使用，步驟繁瑣耗時(shí)，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2　總結(jié)與展望

目前，轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)的難度主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)(如CRISPR基因組定點(diǎn)突變技術(shù))被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研發(fā)[52],使得轉(zhuǎn)基因食品日趨多樣化。然而，利用新技術(shù)生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因食品的基因編輯信息往往不被公開，未知的導(dǎo)入序列增加了轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)難度；另一方面，食品加工技術(shù)水平和加工精度的不斷提高，使得原料DNA的破壞程度更為嚴(yán)重，低質(zhì)量、低濃度的模板DNA給基于核酸分析的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)帶來了困難。

基于核酸分析的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外已得到廣泛應(yīng)用。這類方法不受轉(zhuǎn)錄水平限制，能同時(shí)分析多個(gè)目標(biāo)基因，并且能獲得更多如載體構(gòu)建、植物來源和植物品系等轉(zhuǎn)基因信息，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的特征描述更全面，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。針對(duì)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的現(xiàn)狀，一方面需要進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)雜樣品或深加工樣品的核酸提取和純化技術(shù)，另一方面也應(yīng)研發(fā)如高通量測(cè)序技術(shù)、生物傳感器技術(shù)等特異性和靈敏度更高、檢測(cè)更快速、結(jié)果更準(zhǔn)確的新型核酸檢測(cè)技術(shù)。在實(shí)際檢測(cè)中，可以依據(jù)各技術(shù)優(yōu)劣勢(shì)、食品樣品的加工類型及程度，組合使用不同的檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)化檢測(cè)方法，提高檢測(cè)效率。未來，高通量、自動(dòng)化、微型化、低成本、高靈敏度、高特異性、快速簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確高效的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)及技術(shù)組合將成為轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用的發(fā)展方向。

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（4）經(jīng)分析、判斷和查清滲水范圍或裂縫分布、走向、寬度等，然后對(duì)其鑿至一定深度，一般為8-10cm，并在滲水范圍以外各延長(zhǎng)20 cm，將周圍松動(dòng)的混凝土全部鑿除，在鑿開的凹槽內(nèi)用快凝水泥漿埋設(shè)壓漿咀，其間距通常為1. 0 m左右。在壓漿嘴上接上軋頭、伸縮竹、軟管等裝置，用壓漿機(jī)將防水砂漿或化學(xué)漿液(聚氨酯、丙凝、水玻璃等)壓人，填滿孔隙和裂縫。壓漿一般自上而下進(jìn)行，并記錄時(shí)間，直到孔隙內(nèi)漿液已經(jīng)飽滿，才能停比壓漿并記下壓入漿量。

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