李云龍，張海濤，高　峰，顧開(kāi)朗

（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221006）

溶菌酶作為哺乳動(dòng)物機(jī)體防御因子的重要成員，因?yàn)槠渚哂锌咕?、消炎、組織修復(fù)以及提高免疫力等多方面活性，同時(shí)又是一種天然、無(wú)毒的蛋白質(zhì)，只作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，而對(duì)動(dòng)物機(jī)體無(wú)害，如果能體外構(gòu)建溶菌酶的表達(dá)載體并高效表達(dá)，將具有深遠(yuǎn)的生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。溶菌酶全稱1，4-β-N-溶菌酶，又稱黏肽N-乙?；邗Ｋ饷福軌蛱禺愃饧?xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1，4-糖苷鍵，是一種具有抗菌、溶菌活性的固有免疫效應(yīng)分子 （Prager等，1974）。目前已知在高等反芻動(dòng)物（如牛、羊和鹿等）基因組中存在大概10種溶菌酶相似基因（Irwin等，1989）。然而研究發(fā)現(xiàn)，反芻動(dòng)物雖然有眾多溶菌酶基因，但相對(duì)于其他動(dòng)物機(jī)體缺乏溶菌酶（Prieur，1986）。此外，不同組織溶菌酶表達(dá)差異巨大，牛腎、血液、淚液、乳汁中溶菌酶表達(dá)水平低于大多數(shù)動(dòng)物（Dobson等，1984），牛溶菌酶在乳腺中水平較低，僅為0.05～0.13mg/L，相比之下，人乳腺溶菌酶表達(dá)量可比其高2000～4000倍（Benkerroum，2008）。本研究選擇原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)奶牛乳腺溶菌酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)，以期獲得高效表達(dá)的奶牛溶菌酶蛋白，并檢測(cè)其抑菌活性，為奶牛溶菌酶的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料

1.1載體構(gòu)建表達(dá)試驗(yàn)材料限制性內(nèi)切酶NcoI、XhoI購(gòu)自 Fermentas 公司；T4 DNA Ligase，2×Taq Master Mix，PCR 產(chǎn)物回收試劑盒，膠回收試劑盒，DL 5000 bp Marker，中分子量蛋白 Marker，6×His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒 （Ni-IDA），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自ProbeGene公司；大腸桿菌TOP10菌株由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心保存；SDS，異丙基硫代半乳糖苷-誘導(dǎo)劑（IPTG）購(gòu)自Amersco 公司；Acr、Bis、Tris購(gòu)自 Sigma 公司，其他常規(guī)試劑從國(guó)藥集團(tuán)采購(gòu)。

1.2抑菌試驗(yàn)材料雙抗儲(chǔ)存液（100×）制備：氨芐青霉素100萬(wàn)單位，鏈霉素100萬(wàn)單位，加重蒸水至100mL過(guò)濾除菌，用小瓶分裝，每瓶5mL，-20℃保存?zhèn)溆?。人溶菌酶?biāo)品購(gòu)自Merck公司，大腸桿菌BL21、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、沙門(mén)氏菌菌種為由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室提供。

2　方法

2.1LYZ基因cDNA鏈的合成根據(jù)已知的奶牛LYZ基因mRNA序列（NCBI Reference Sequence：NM_001077829.1）， 用 Primer Premier 6.0軟件將其翻譯為cDNA序列，并由上海生工公司合成。序列如下：CCATGGCTAAGAAATTTCAG CGTTGTGAGCTGGCGCGGACGCTGAAAAAGCTG GGGCTGGACGGCTACCGGGGCGTGAGTTTAGCA AACTGGGTTTGTCTGGCACGTTGGGAGAGTAAT TATAATACGAGAGCAACAAATTACAACCGTGGT GATAAAAGCACAGATTATGGTATTTTTCAGATC AATAGCCGTTGGTGGTGTAATGATGGGAAAACA CCGAAAGCAGTGAATGCATGTCGGATTCCGTGT AGCGCACTGCTGAAAGATGATATCACCCAGGCG GTTGCATGTGCGAAGCGCGTTGTGAGAGATCCC CAGGGGATTAAAGCATGGGTTGCATGGCGTAAC AAATGTCAAAATAGAGACCTGAGAAGCTACGTG CAGGGGTGTCGGGTTTAACTCGAG。其中CCAT GG為引入的NcoI酶切位點(diǎn)、CTCGAG為引入的XhoI酶切位點(diǎn)。

2.2酶切反應(yīng)采用雙酶切獲得目的片段，以下體系放入37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h后，膠回收獲得載體片段和目標(biāo)片段。pET32T載體采用NcoI、XhoI雙酶切線性化后通過(guò)膠回收獲得載體片段。酶切反應(yīng)體系如下：

目的片段酶切體系50μL：目的片段1μg，10× FD Buffer 5 μL，NcoI 1 μL（10 U/μL），XhoI 1 μL （10 U/μL），加 ddH2O 至 50 μL。

載體的酶切體系50μL：載體1μg，10×FD Buffer 5 μL，NcoI 1 μL（10 U/μL），XhoI 1 μL（10 U/μL），加 ddH2O 至 50 μL。

2.3連接反應(yīng)將上述回收純化好的目的DNA片段和載體片段，進(jìn)行連接，按下述反應(yīng)體系22℃在PCR儀中連接反應(yīng)1 h。反應(yīng)體系如下：載體片段4μL，目的基因片段8μL，10×T4 DNAligase Buffer 2 μL，T4 DNAligase1 μL（400 U/μL），加ddH20至 20μL。

2.4重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定挑選單菌落生長(zhǎng)后用T7通用引物PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆。T7通用引物：T7上游引物 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’，T7 下 游 引 物 5’ -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。PCR擴(kuò)增條件：94℃5min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃2min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠檢測(cè)。挑選單菌落提取質(zhì)粒，采用NcoI、XhoI雙酶切驗(yàn)證條帶大小，反應(yīng)體系如下：載體1μg，10×FD Buffer 5 μL，NcoI 1 μL（10 U/μL），XhoI 1 μL（10 U/μL），加 ddH20至 50μL。37 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 h。酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

2.5融合蛋白pET32T-LYZ的表達(dá)和分析挑取單克隆接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基 （含50mg/L氨芐），37℃培養(yǎng)約4 h，OD600為0.6左右，加入終濃度為0.6mM的IPTG誘導(dǎo)pET32T-LYZ的表達(dá)。37℃誘導(dǎo)2 h后收集菌體，處理后的菌體蛋白樣品進(jìn)行13%SDS-PAGE電泳。

2.6LYZ體外抑菌試驗(yàn)采用高壓流通蒸汽滅菌，在超凈工作臺(tái)中制備普通瓊脂培養(yǎng)基平板，待平板凝固，將液體培養(yǎng)的不同菌株均勻涂布于表面，利用同樣的滅菌的打孔器均勻打孔，將純化定量的LYZ、雙抗儲(chǔ)存液（陽(yáng)性對(duì)照）、滅菌生理鹽水（空白對(duì)照）各取10μL加入不同培養(yǎng)板孔。放置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，測(cè)定各板的抑菌環(huán)并記錄。

3　結(jié)果與分析

3.1PCR篩選陽(yáng)性克隆鑒定結(jié)果隨機(jī)挑選單菌落，用pET32T載體的T7通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1000bp位置處出現(xiàn)明亮條帶（圖1），與預(yù)期產(chǎn)物大小一致，表明克隆結(jié)果為陽(yáng)性。

圖1　LYZ-pET32T菌落PCR鑒定

3.2重組陽(yáng)性克隆酶切驗(yàn)證挑選單個(gè)菌落并提取質(zhì)粒，用NcoI、XhoI雙酶切驗(yàn)證條帶大小，如圖2。得到與理論值400bp相符的條帶，說(shuō)明LYZ基因已成功克隆至pET32T載體中。

3.3表達(dá)及純化產(chǎn)物的鑒定SDS-PAGE電泳圖片顯示（圖3），在IPTG誘導(dǎo)后，出現(xiàn)一條約為33 kD的蛋白條帶，與理論分子量相當(dāng)，表明LYZ蛋白表達(dá)成功。

3.4LYZ抑菌活性檢測(cè)抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），純化的LYZ對(duì)大腸桿菌BL21、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌及沙門(mén)氏菌均形成抑菌環(huán)，表明LYZ對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制，并且抑菌環(huán)的大小和劑量相關(guān)。

圖2　LYZ-pET32T限制性酶切驗(yàn)證結(jié)果

圖3　表達(dá)及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

表1　重組LYZ體外抗菌試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

4　討論

溶菌酶在食品、工業(yè)和醫(yī)學(xué)中有巨大的應(yīng)用，在飼料生產(chǎn)與家畜飼養(yǎng)中，配合其他添加劑可以延長(zhǎng)飼料的貯存期，同時(shí)又可以預(yù)防和治療動(dòng)物消化道腹瀉等疾病。邢思華等（2012）研究表明，在基礎(chǔ)飼料中添加溶菌酶制對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能和抗感染能力有顯著影響。目前，在臨床上主要使用抗生素來(lái)防治奶牛乳房炎，雖有一定的效果，但耐藥菌株日益增多，抗生素殘留問(wèn)題始終得不到解決，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身心健康（Wright等，2005），有學(xué)者嘗試將具有較高活性的人溶菌酶基因轉(zhuǎn)入到奶牛（Yang 等，2011）和奶山羊（Maga 等，2006），使牛、羊乳腺分泌表達(dá)人溶菌酶，從而提高對(duì)乳房炎的抵抗力。楊睿等（2014）用不同來(lái)源的四種溶菌酶對(duì)引起奶牛乳房炎的葡萄球菌做抑菌試驗(yàn)，并從中篩選出抑菌效果最好的樣品。沈誠(chéng)等（2011）構(gòu)建人的溶菌酶基因表達(dá)載體，將其注入患有乳房炎的奶牛的乳腺組織，用于治療奶牛乳房炎，治愈率高達(dá)97.4%。本研究對(duì)純化得到的奶牛溶菌酶進(jìn)行了抑菌性檢測(cè)，結(jié)果表明奶牛溶菌酶對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，且隨著劑量的增加，抑菌效果也顯著增加，提示奶牛溶菌酶可以作為一種新型的藥物來(lái)預(yù)防和治療奶牛乳房炎，不僅能夠有效遏制濫用抗生素導(dǎo)致的一系列問(wèn)題，而且不會(huì)對(duì)人產(chǎn)生免疫原性，對(duì)于動(dòng)物抗病育種意義重大。但是奶牛溶菌酶對(duì)有益菌同樣也有抑菌效果，動(dòng)物食用了含有溶菌酶的飼料后是否對(duì)腸道健康的微生態(tài)菌群有破壞作用，還需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)所獲得的重組奶牛溶菌酶是通過(guò)將溶菌酶基因轉(zhuǎn)化原核大腸桿菌并在體外純化收集得到的，其本質(zhì)屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，雖然張璐瑩等（2015）對(duì)牛乳溶菌酶的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，認(rèn)為重組牛乳溶菌酶制劑具有安全性，符合黏膜局部用藥標(biāo)準(zhǔn)，但長(zhǎng)期使用這類(lèi)藥物的安全性問(wèn)題還需進(jìn)一步評(píng)估。

溶菌酶在真核系統(tǒng)和原核系統(tǒng)中表達(dá)的報(bào)道有很多。齊長(zhǎng)學(xué)（2010）構(gòu)建酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαA-LYZ1，并在受體菌 BL21（DE3）和 GS115中成功表達(dá)，章歡（2006）將牛溶菌酶基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，同樣獲得了良好的表達(dá)效果。有研究表明，溶菌酶對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的殺菌作用，對(duì)宿主菌有一定毒性，致使溶菌酶在大腸桿菌中無(wú)法直接表達(dá)。從本試驗(yàn)的結(jié)果看，表達(dá)的蛋白以無(wú)活性的包涵體形式存在，很好地避免了上述問(wèn)題，后續(xù)可以利用簡(jiǎn)單的超聲裂解和離心方法即可獲得純化的重組蛋白，便于研究重組蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。

本研究在獲得目的基因CDS序列時(shí)，采用的是人工設(shè)計(jì)并合成的方法，這與付世新等（2010）所采用的方法一致，而王洪亮（2014）在獲得LYZ基因CDS序列時(shí)，采用了RT-PCR的方法，結(jié)果某些亞型溶菌酶基因由于表達(dá)量很低沒(méi)有克隆成功。本試驗(yàn)決定采用人工合成的方法獲得目的基因片段，主要原因有三點(diǎn)：一是目的片段堿基含量較少，用合成的方法可以大大降低成本；二是合成的片段是高保真的，不會(huì)因?yàn)椴蓸訒r(shí)個(gè)人的差異造成堿基的突變；三是可以在合成的片段上加以修飾，增加一些酶切位點(diǎn)，方便后續(xù)的連接反應(yīng)。

5　結(jié)論

本研究成功構(gòu)建原核表達(dá)載體LYZ-pET32T，通過(guò)誘導(dǎo)獲得了高效表達(dá)的奶牛溶菌酶蛋白，并檢測(cè)了其抗菌性，為進(jìn)一步推廣奶牛溶菌酶的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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