孫 敏 ，田 野 ，崔高超 ，魏騰飛 ，楊 芳

藥食同源的桑葚因其果肉多汁、色澤艷麗、香氣幽雅、色素含量高且穩(wěn)定，是釀酒的極佳原料［1］。桑葚中黃酮類化合物具有增強(qiáng)毛細(xì)血管強(qiáng)度、抗自由基、抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等生物學(xué)活性［2－8］。 桑葚水解物含槲皮素－3－O－蕓香苷、槲皮素己糖苷、槲皮素鼠李糖基己糖苷、山奈酚、鼠李糖苷、花青素－3－O－葡萄糖苷和花青素－3－O－蕓香苷具有抑制膳食丙烯酰胺誘導(dǎo)的活性氧過度產(chǎn)生，恢復(fù)細(xì)胞線粒體膜電位，抑制線粒體膜脂質(zhì)過氧化和谷胱甘肽的消耗，對抗膳食丙烯酰胺引發(fā)的細(xì)胞毒性，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用［9］。目前，桑葚果酒的加工方法有浸提法和發(fā)酵法。浸提法以桑葚為原料，選擇合適的酒基進(jìn)行浸泡。乙醇可以將桑葚中許多有益的成分萃取到酒中，這樣不僅將不易存放的桑葚保存，還能將桑葚的保健成分萃取出來。果酒中的總糖、總酸都是決定果酒口感的重要風(fēng)味物質(zhì)。有機(jī)酸具有抑菌、抗病毒、增加冠動(dòng)脈流量、抑制腦組織脂質(zhì)過氧化等作用。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化法是一種新型的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。較均勻設(shè)計(jì)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化法更能夠靈敏地考察各因素間的交互作用，精確度更高，近些年逐漸被用于食品科學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)［10，11］。本研究通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化法來對浸泡型桑葚果酒制作條件進(jìn)行設(shè)計(jì)，選擇料液比、酒基乙醇體積分?jǐn)?shù)、桑葚粉碎時(shí)間為自變量，桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分作為因變量，對自變量各因素水平進(jìn)行多元線性回歸和多項(xiàng)式擬合，通過數(shù)學(xué)模型進(jìn)行預(yù)測最佳浸泡型桑葚果酒制作工藝參數(shù)。

1　材料與方法

1.1　材料

桑葚：大十新鮮桑葚，產(chǎn)自陜西省安康市漢濱區(qū)張灘鎮(zhèn)。酒基為市售二鍋頭白酒（60%，V／V）。

1.2　儀器

SP－723型分光光度計(jì) （上海光譜儀器有限公司）、UPT－II超純水機(jī) （四川優(yōu)普超純科技有限公司）、ALC－210.4型微量分析天平 （德國賽多利斯公司）、Legend Micro17R微量冷凍高速離心機(jī) （美國Thermo公司）、PHS－3C pH計(jì) （上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3　藥品與試劑

30～60目聚酰胺、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化銨、無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、石油醚、無水硫酸鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、乙醇、乙酸均為分析純，甲醇、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純。

1.4　方法

1.4.1浸泡型桑葚果酒總糖含量的測定 采用3，5－二硝基水楊酸法（DNS 法）測定［12］。 取一定量的待測桑葚果酒樣品，裝入離心管中，以3 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取0.5 mL放入100 mL的三角瓶中，加入 7.5 mL的去離子水和 5 mL 6 mol／L的HC l，置于68℃水浴中加熱水解15 min。待其冷卻后，用6 mol／L的NaOH中和多余的酸。用去離子水將其定容到25 mL的容量瓶中混勻，即得待測液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制（1.0 mg／mL）：在分析天平上準(zhǔn)確稱取0.100 0 g分析純葡萄糖（預(yù)先在105℃干燥至恒重），溶于去離子水中。依次移取0、0.2、0.4、0.8、1.2 mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液、2.0 mL 去離子水于6個(gè)5 mL比色管中，加去離子水補(bǔ)足至2 mL，再在每個(gè)容量瓶中加入1.5 mL顯色劑DNS，搖勻后將6個(gè)容量瓶放在沸水浴中加熱5 min，立即冷卻。用去離子水定容至25 mL，搖勻。以去離子水顯色反應(yīng)液做空白調(diào)零，用1 cm比色皿在540 nm處測其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

總糖的測定：取20支25 mL的刻度試管編號，每管移取1 mL浸泡型桑椹果酒多糖的待測液、加去離子水補(bǔ)足至2 mL，再在每個(gè)容量瓶中加入1.5 mL顯色劑DNS。加熱、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法相同。

總糖含量（g／L）＝查曲線所得水解后的還原糖（g／L）×稀釋倍數(shù)（100×25）×0.9

1.4.2浸泡型桑葚果酒總酸含量的測定 用鄰苯二甲酸氫鉀作基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定NaOH溶液。桑葚果酒12 000 r／min離心10 min后，移取上清液2 mL至離心管。用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，利用pH計(jì)來調(diào)節(jié)終點(diǎn)電位與預(yù)控電位。滴定終點(diǎn)電位是8.3［13］。記錄此時(shí)消耗的氫氧化鈉的體積。按下列公式計(jì)算桑葚果酒總酸含量：總酸含量（g／L）＝C×Vk×V1／V2，其中，C 為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（g／mL），Vk為檸檬酸系數(shù)［14］，V1為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗體積（mL），V2為桑葚果酒上清液取樣體積（L）。

1.4.3浸泡型桑葚果酒總黃酮的測定 采用聚酰胺吸附－硝酸鋁顯色法測定［15］。聚酰胺預(yù)處理：用90%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去起泡后裝柱。用3倍體積的90%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘?jiān)?。依次?倍體積5%氫氧化鈉溶液、1倍體積的去離子水、2倍體積10%乙酸水溶液洗脫，最后用去離子水洗脫至pH中性，備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確稱取干燥的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品［16］10.60 mg 于 25 mL 容量瓶中，用 70%甲醇溶解，定容至刻度，得到濃度為424.0μg／mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液。 分別準(zhǔn)確吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞試管中，用30%乙醇定容至5 mL，然后向每管中分別加入0.3 mL 5%NaNO2，搖勻后靜置 5 min，分別加入 0.3 mL 10%Al（NO3）3，搖勻后靜置 6 min，再分別加入 2 mL 1 mol／L NaOH，用30%乙醇定容至刻度，搖勻后靜置20 min，于510 nm處測定吸光度，以空白試劑為參比。

將顆粒狀聚酰胺混懸于水中，使其充分膨脹，然后裝柱20 mL。準(zhǔn)確吸取1.0 mL桑椹果酒樣品，經(jīng)3 500 r／min離心10 min加入30～60目的聚酰胺層析柱中。用30 mL 70%甲醇洗脫，流速72滴／min，從甲醇溶液滴入水溶液中之后開始收集洗脫液，得到1.5 mL洗脫液。準(zhǔn)確吸取4.0 mL洗脫液按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行反應(yīng)，顯色測定。為扣除底色的影響，取 4.0 mL 洗脫液用 30%乙醇稀釋至 10.0 mL，作為參比。

1.5　響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法（RSM）對影響浸泡型桑葚果酒制作的主要因素料液比（V／V，下同）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）和粉碎時(shí)間（min）3個(gè)因素為響應(yīng)因素進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)因素設(shè)計(jì)5個(gè)水平，分別用代碼-α、-1、0、1、α（α＝1.682）表示，設(shè)計(jì)因素與水平見表1。以浸泡型桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)安排。

表1　星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素與水平

1.6　浸泡型桑葚果酒感官綜合評價(jià)

浸泡型桑葚果酒制備完成，從果酒的色澤、香氣、滋味、風(fēng)格4個(gè)方面對桑葚果酒進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

2　結(jié)果與分析

2.1　葡萄糖的測定線性關(guān)系考察

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為1 mg／mL，以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度 0、0.008、0.016、0.024、0.032、0.04、0.048 mg／mL為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)的吸光度（OD值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得直線回歸方程為 Y＝14.179X－0.000 7（R2＝0.994 4），表明在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2　浸泡型桑葚果酒感官評定標(biāo)準(zhǔn)

2.2　槲皮素的測定線性關(guān)系考察

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為424.0μg／mL，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度 0、8.48、16.96、25.44、33.92、42.40、50.88、59.36 mg／L為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得直線回歸方程為 Y＝0.007 2X－0.002 3（R2＝0.999 7），表明在線性范圍內(nèi)（8.48～59.36 mg／L）線性關(guān)系良好。

2.3　星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及響應(yīng)面分析

依據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)－響應(yīng)面法試驗(yàn)方案進(jìn)行3因素5水平試驗(yàn)，星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排與桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分4個(gè)響應(yīng)值結(jié)果見表3。

表3　星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.4　模型擬合及工藝優(yōu)化

以浸泡型桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分分別為因變量，使用Design－Expert軟件采用二次多項(xiàng)式非線性模型對各影響因素和指標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，其方程如下：

2.5　響應(yīng)曲面與等高線

采用Design expert 7軟件繪制二次多項(xiàng)式模型中X1、X2、X3中任意2因素對各評價(jià)指標(biāo)的三維效應(yīng)曲面（其余自變量設(shè)為中心點(diǎn)值），見圖1至圖4。通過響應(yīng)面三維圖，可直觀地反映各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，有助于確定最佳浸泡工藝參數(shù)范圍。

圖1　粉碎時(shí)間和料液比對浸泡型桑葚果酒總糖影響的三維曲面和等高線

圖3　粉碎時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對浸泡型桑葚果酒總黃酮影響的三維曲面和等高線

2.6　驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)Design expert 7軟件處理后得到的最佳條件為料液比為 59.70∶100，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 50.85%，粉碎時(shí)間為0.89 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，浸泡型桑葚果酒共3份，按照“1.4”各項(xiàng)方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表4。根據(jù)優(yōu)化浸泡工藝參數(shù)，平行制備3份樣品，所得浸泡型桑葚果酒各指標(biāo)實(shí)測值與理論預(yù)測值接近，表明建立的回歸方程預(yù)測性良好。

表4　優(yōu)化浸泡制作工藝驗(yàn)證結(jié)果

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)和粉碎時(shí)間對浸泡型桑葚果酒總酸影響的三維曲面和等高線

圖4　乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對浸泡型桑葚果酒感官綜合評分影響的三維曲面和等高線

3　小結(jié)

選擇料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、粉碎時(shí)間為自變量，浸泡型桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分作為因變量，對自變量各因素水平進(jìn)行多元線性回歸和多項(xiàng)式擬合。通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)－響應(yīng)面法優(yōu)化浸泡型桑椹果酒制作工藝，得到的最佳浸泡制作工藝參數(shù)為料液比 59.70∶100，乙醇體積分?jǐn)?shù) 50.85%，粉碎時(shí)間0.89 min。浸泡型桑葚果酒預(yù)測值分別為總糖 28.00 g／L、總酸 1.82 g／L、總黃酮 101.76 mg／L、感官綜合評分90.00。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，浸泡桑葚果酒共3份，各項(xiàng)指標(biāo)實(shí)測值分別為總糖27.27 g／L、總酸 1.87 g／L、總黃酮 99.92 mg／L、感官綜合評分88.00分。實(shí)測值與模型預(yù)測值間的偏離率分別為－2.6%、2.7%、－1.8%、－2.2%。根據(jù)優(yōu)化浸泡制作工藝參數(shù)，平行制備3份樣品，所得浸泡型桑葚果酒各指標(biāo)實(shí)測值與理論預(yù)測值接近，表明建立的回歸方程預(yù)測性良好。

參考文獻(xiàn)：

［1］李冬香，陳清西.桑葚功能成份及其開發(fā)利用研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（24）：293－297.

［2］ SCAMBIA G，PANICI P B，RANELLETTI F O，et al.Quercetin enhances transforming growth factor beta 1 secretion by human ovarian cancer cells［J］.Int J Cancer，1994，57（2）：211－215.

［3］ CHAUDHARY A，PECHAN T，WILLETT K L.Differential protein expression of peroxiredoxin I and II by benzo （a）pyrene and quercetin treatment in 22Rv1 and PrEC prostate cell lines［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2007，220（2）：197－210.

［4］ SRIVASTAVA R K，TANG S N，ZHU W，et al.Sulforaphane synergizes with quercetin to inhibit self－renewal capacity of pancreatic cancer stem cells［J］.Front Biosci，2011，3：515－528.

［5］ THAPA M，KIM Y，DESPER J，et al.Synthesis and antiviral activity of substituted quercetins［J］.Bioorg Med Chem Lett，2012，22（1）：353－356.

［6］ COELHO－DOS－REISJG，GOMESO A，BORTOLINI D E，et al.Evaluation of the effects of quercetin and kaempherol on the surface of MT－2 cells visualized by atomic force microscopy［J］.J Virol Methods，2011，174（2）：47－52.

［7］ GRAVINA H D，TAFURI N F，SILVA JNIOR A，et al.In vitro assessment of the antiviral potential of trans－cinnamic acid，quercetin and morin against equid herpesvirus 1［J］.Res Vet Sci，2011，91（3）：158－162.

［8］ ZHANG L，CHENG Y X，LIU A L，et al.Antioxidant，anti－inflammatory and anti－influenza properties of components from Chaenomeles speciosa［J］.Molecules，2010，15（11）：8507－8517.

［9］ ZHANG L，XU Y，LI Y，et al.Protective property of mulberry digest against oxidative stress－A potential approach to ameliorate dietary acrylamide－induced cytotoxicity［J］.Food Chem，2017，230：306－315.

［10］ KAPLAN INCE O，INCE M，YONTEN V，et al.A food waste utilization study for removing lead （II） from drinks［J］.Food Chem，2017，1（214）：637－643.

［11］ KOLA A K，MEKALA M，GOLI V R.Experimental design data for the biosynthesis of citric acid using central composite design method［J］.Data Brief，2017，8（12）：234－241.

［12］ 涂紹勇，楊愛華，梅雙喜，等.3，5－二硝基水楊酸法（DNS）測定殼聚糖酶活力的探討［J］.食品科技，2012，18（1）：240－242，245.

［13］童曉濱，安紅綱.關(guān)于強(qiáng)堿弱酸滴定終點(diǎn)與指示劑的選擇及滴定順序［J］.河西學(xué)院學(xué)報(bào)，1989（1）：131－137.

［14］沈 穎，劉曉艷，白衛(wèi)東，等.果酒中有機(jī)酸及其對果酒作用的研究［J］.中國釀造，2012，31（2）：29－30.

［15］陳 娟.發(fā)酵型蜂蜜桑椹酒的釀造技術(shù)及品質(zhì)特征研究［D］.重慶：西南大學(xué)，2009.

［16］楊 芳.富硒桑葚果酒蘆丁和槲皮素含量的分析［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（17）：3842－3845.