張曉青，杜瑾，曹軍瑞，司曉光，張愛君，任華峰

國家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津300192

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，排放到環(huán)境中的重金屬離子不斷增加。鉛是生態(tài)環(huán)境中常見的重金屬污染物之一，鉛及其化合物廣泛存在于印染、電鍍、冶煉、橡膠、紡織等工業(yè)廢水中[1-2]。鉛不僅能通過皮膚接觸、飲用進(jìn)入人體，還可通過食物鏈傳遞在生物體內(nèi)累積，危害人類健康[3-4]。

利用自然環(huán)境中耐受微生物處理重金屬污染，具有種類多、成本低、安全高效等優(yōu)勢，是目前研究的熱點(diǎn)[5-6]。微生物表面存在羧基、氨基、酰胺基等功能基團(tuán)和活性位點(diǎn)，可以通過氧化還原、甲基化和脫氫作用等方式將重金屬離子轉(zhuǎn)化為無毒或低毒的化合物[7]，還有一些微生物可以分泌對重金屬具有絡(luò)合作用的胞外多糖、脂類等表面活性物質(zhì)[8]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、放線菌、真菌等多種微生物對鉛離子具有很好的吸附作用[9-10]，同時還有研究表明非活性菌株對重金屬的吸附效果優(yōu)于活性菌株[11-12]。

我們選取天津?yàn)I海近岸沉積物進(jìn)行耐性優(yōu)勢細(xì)菌篩選，通過生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA 序列對該菌株進(jìn)行鑒定分析，并考察pH 值、吸附劑投加量、Pb2+的初始濃度、吸附時間等環(huán)境變量對菌株吸附Pb2+性能的影響，運(yùn)用不同模型擬合其生物吸附過程，以期為微生物修復(fù)重金屬污染環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

耐鉛菌株分離于天津?yàn)I海新區(qū)近岸沉積物，經(jīng)馴化篩選后保藏于本實(shí)驗(yàn)室中。原子吸收光譜儀（Analytikjena 公司）；高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；pH 計(jì)（Thermo 公司）；全溫振蕩器（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司）。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（2216E）：蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，高磷酸鐵0.1 g，陳海水1000 mL，瓊脂20 g（固體培養(yǎng)基），pH7.6。

選擇培養(yǎng)基：將硝酸鉛加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)所需要的濃度。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，水1000 mL，pH7.0～7.2。

1.2 菌株的篩選與分離

稱取10 g 沉積物樣品于90 mL 無菌水中，空曝4 h，靜置后取1 mL 上清液接入Pb2+濃度為100 mg/L 的2216E 液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min搖床培養(yǎng)1～3 d，培養(yǎng)液變渾濁后，將此菌懸液稀釋至10-2～10-6，涂布在Pb2+濃度為100 mg/L 的平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，觀察結(jié)果。

挑取平板上菌落特征有明顯差異的單菌落，繼續(xù)在Pb2+濃度分別為100、200、300 mg/L 的固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，直至獲得鉛耐受能力最強(qiáng)的單一菌株。純化后的菌株接種牛肉膏蛋白胨斜面，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 生理生化特征分析 耐鉛菌株進(jìn)行APT ZYM 19 種酶活、API 20NE 21 項(xiàng)指標(biāo)、過氧化氫酶、氧化酶等指標(biāo)測定，方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]。

1.3.2 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 16S rDNA 基因PCR 擴(kuò)增引物為fd1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和rp2（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序。將所測得菌株的16S rDNA 序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的16S rDNA 序列進(jìn)行BLAST 對比分析，利用MEGA5.2 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 非活性吸附劑的制備

挑取NY-3 單菌落轉(zhuǎn)接到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min 恒溫培養(yǎng)24 h，10 000 r/min 離心5 min 收集菌體，用去離子水清洗2～3 次，冷凍干燥，研磨過篩，保存于干燥器中備用。

1.5 影響菌株對鉛吸附的因素

稱取一定量的菌粉添加至100 mL 含不同質(zhì)量濃度鉛的廢水中，置于250 mL 錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH 值為3～8、菌體生物量為0.5～4 g/L、金屬離子初始濃度為10～300 mg/L，接觸時間為0～240 min，25℃、160 r/min 恒溫吸附，吸附后10 000 r/min 離心5 min，采用原子吸收分光光度法測定上清液中剩余Pb2+濃度。實(shí)驗(yàn)中溶液pH 值用1 mol/L 的NaOH 或HNO3溶液調(diào)節(jié)。用下式分別計(jì)算吸附量（q，mg/g）和吸附率（p，%）：

式中，c0為溶液中Pb2+初始濃度（mg/L），c1為吸附平衡后Pb2+離子（mg/L），V為溶液體積（L），ms為投加吸附劑干重（g）。

2 結(jié)果

2.1 耐鉛優(yōu)勢菌株的篩選與鑒定

經(jīng)分離篩選，得到1 株能在Pb2+濃度為300 mg/L 培養(yǎng)基上生長的菌株NY-3。菌株呈黃色，不透明，圓形凸起，邊緣整齊，在顯微鏡下呈粗短桿狀。菌株生理生化鑒定見表1、2，菌株能還原硝酸鹽和亞硝酸鹽，氧化酶和過氧化酶為陽性，精氨酸雙水解反應(yīng)為弱陽性，脲酶反應(yīng)為陽性，能利用蘋果酸、檸檬酸三鈉、苯乙酸為碳源。

對菌株NY-3 的16S rDNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增，通過GenBank 進(jìn)行同源性比對，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），鑒定該菌為Oceanimonassp.。

2.2 活體和非活性菌株吸附情況

低速離心收集對數(shù)生長期菌株NY-3 的發(fā)酵液，用去離子水清洗2 次，直接加入100 mL Pb2+濃度為50 mg/L 的廢水中；取等量的活體細(xì)胞，冷凍干燥后加入100 mL Pb2+濃度為50 mg/L 的廢水中，考察活體和非活性菌株的吸附情況，結(jié)果見表3。可以看出，NY-3 非活性菌株仍具有對Pb2+的吸附能力，其吸附率還略微高于活體菌株。因此，可以用非活性菌株進(jìn)行生物吸附研究，克服活體菌株作為生物吸附劑進(jìn)行廢水處理時易受環(huán)境因素影響的不足。

表1 API ZYM檢測19種酶活

表2 API 20NE檢測21項(xiàng)指標(biāo)

表3 活體和非活性菌株吸附情況

圖1 菌株NY-3 的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 pH值對NY-3吸附性能的影響

pH 值能影響生物吸附劑菌體表面結(jié)構(gòu)和重金屬離子存在的形態(tài)，進(jìn)而影響吸附劑與重金屬離子之間的相互作用，在Pb2+濃度為50 mg/L、NY-3 投加量為1 g/L 的條件下，pH 值對菌株NY-3 吸附的影響見圖2?？梢钥闯?，pH 值對菌株NY-3 吸附影響作用非常大，隨著pH 值的提高，吸附率呈先增加后降低的趨勢。pH3 時，Pb2+吸附率僅為2.42%，隨著pH 值升高（4～7），菌體表面吸附位點(diǎn)被釋放出來，Pb2+吸附率顯著升高，pH6 時吸附率和吸附容量分別為94.41%和45.53 mg/g；繼續(xù)升高pH 值至8，吸附率和吸附量都降低。據(jù)此，選擇pH6 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 生物量對NY-3吸附性能的影響

Pb2+初始濃度50 mg/L，pH6，菌株NY-3 投加量分別為0.5、1、2、3、4 g/L，25℃、160 r/min 振蕩吸附4 h，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)菌體投加量為0～4 g/L 時，隨著菌株NY-3 質(zhì)量濃度的增加，Pb2+的去除率增加，菌體投加量為4 g/L 時Pb2+的去除率達(dá)97.07%，而單位菌體吸附量隨著生物量的增加而減小，由46.15 降到11.31 mg/g。從圖3 還可知，當(dāng)菌株生物量超過1 g/L 時，吸附率增加不明顯，綜合考慮Pb2+的吸附率和NY-3 的利用率，菌體的最佳投加量為1 g/L。

圖2 pH 值對菌株NY-3 吸附Pb2+性能的影響

圖3 投菌量對菌株NY-3 吸附Pb2+性能的影響

圖4 金屬離子初始濃度對NY-3 吸附Pb2+性能的影響

圖5 Langmuir 和Freundlich 吸附等溫線

2.5 Pb2+初始濃度對NY-3吸附性能的影響

金屬離子濃度是影響重金屬生物吸附的一個重要因素，當(dāng)Pb2+初始濃度為10～300 mg/L，吸附劑投加量為1 g/L，25℃、160 r/min 振蕩吸附4 h 的吸附效果見圖4。Pb2+濃度低于100 mg/L 時吸附率大于90%，且隨著Pb2+濃度增加吸附量增加；繼續(xù)升高Pb2+初始濃度，吸附率下降，當(dāng)Pb2+濃度為300 mg/L 時去除率僅為22.3%。

2.6 NY-3對Pb2+吸附的等溫模型分析

采用Langmuir 和Freundlich[14]等溫吸附模型對Pb2+初始濃度為0～100 mg/L 的吸附過程進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖5 所示。菌株NY-3 吸附Pb2+Lang?muir 等溫模型相關(guān)系數(shù)R2（0.9978）高于Freundlich等溫吸附模型（0.9701）等溫吸附模型，NY-3 對Pb2+吸附過程更符合Langmuir 等溫吸附方程。

2.7 吸附時間對NY-3吸附性能的影響

Pb2+濃度50 mg/L，pH6，NY-3 投加量1 g/L，25℃、160 r/min 振蕩吸附4 h，分別測定吸附反應(yīng)不同時間時NY-3 對廢水中Pb2+的吸附效果，結(jié)果如圖6。NY-3 對Pb2+的吸附是一個快速的過程，最初反應(yīng)5 min 時吸附率達(dá)45.59%，吸附量達(dá)23.44 mg/g；60 min 時吸附率為94.16%，吸附量達(dá)40.58 mg/g；繼續(xù)延長吸附時間，菌株表面活性劑位點(diǎn)吸附趨于飽和，吸附率和吸附量增加緩慢。因此，本實(shí)驗(yàn)選取最佳吸附時間為60 min。

2.8 吸附動力學(xué)研究

通常二價(jià)金屬離子的生物吸附過程可以用如下二級動力學(xué)方程來擬合：

式中，q為吸附平衡時吸附量（mg/g），qt為t時刻Pb2+的吸附量（mg/g），k2為二級反應(yīng)動力模型的速率常數(shù)［g/（mg·min）］。

采用準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)模型擬合的結(jié)果如圖7。結(jié)果顯示準(zhǔn)二級動力學(xué)方程可以較好地?cái)M合NY-3 對Pb2+的吸附過程，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9997，q為42.55 mg/g，與實(shí)驗(yàn)得到最大吸附量41.38 mg/g接近。

圖6 時間對NY-3 吸附Pb2+的影響

圖7 NY-3 吸附Pb2+的準(zhǔn)二級動力學(xué)模型

3 討論

從天津市濱海近岸沉積物中篩選分離出1 株耐鉛菌株NY-3，經(jīng)生理生化及16S rDNA 鑒定，該菌為Oceanimonassp.。NY-3 非活性菌株對Pb2+具有較高的吸附能力，這可能因?yàn)镹Y-3 是通過菌體表面吸附機(jī)制把金屬離子固定在細(xì)胞表面，與吸附劑生理作用關(guān)系很小，菌體的死亡不影響其吸附能力[13]。

由pH 值對吸附Pb2+的影響實(shí)驗(yàn)可見，隨著pH 值的提高，吸附率均呈先增加后降低的趨勢，這可能是在低pH 值時，菌體表面的吸附活性位點(diǎn)被H+和H3O+占據(jù)，導(dǎo)致吸附效果較差；隨著pH值升高（4～7），菌體表面吸附位點(diǎn)被釋放出來，Pb2+吸附率顯著升高；pH 值較高時，Pb2+與水中的OH-結(jié)合形成沉淀覆蓋在細(xì)菌細(xì)胞壁表面，導(dǎo)致吸附位點(diǎn)減少，阻礙了NY-3 對Pb2+的吸附作用，去除率降低[14]。吸附率隨著菌體的增加而增大，這是因?yàn)閷τ谔囟ń饘贊舛龋S著菌體投加量的增加，菌體表面吸附位點(diǎn)隨之增加，菌體細(xì)胞與Pb2+充分接觸，去除率升高，吸附量較高。當(dāng)菌株生物量超過1 g/L 時，吸附率增加不明顯，可能菌體細(xì)胞間活性位點(diǎn)相互競爭，吸附活性位點(diǎn)被覆蓋，菌體與重金屬離子不能充分利用，導(dǎo)致菌體吸附量降低[15-16]。NY-3 對Pb2+的吸附率隨著金屬離子濃度的增加而降低，這是由于金屬離子濃度較低時，NY-3 表面吸附位點(diǎn)沒有被Pb2+充分占據(jù)，隨著Pb2+濃度增加，吸附劑表面吸附位點(diǎn)被占滿后，吸附率下降。

等溫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株NY-3 對廢水中Pb2+的吸附能較好地?cái)M合Langmuir 吸附模型，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.9987，吸附以單層吸附為主，吸附質(zhì)以單分子形式附著在吸附劑表面；吸附過程可用準(zhǔn)二級動力學(xué)模型擬合，qm為42.55 mg/g，與實(shí)驗(yàn)得到最大吸附量41.38 mg/g 接近。